瞬时感受器电位离子通道香草素受体亚型1(Transient receptor potential Vanilloid 1,TRPV1),是一个含有6次跨膜结构的非选择性通透阳离子的离子通道,它能够被辣椒素、炎性介质、酸、以及内源性的大麻素和花生四烯酸等所激活,同时还能够响应温度刺激(>42℃)。由于能够响应种类众多的刺激,TRPV1通道因此被称为多觉感受器(Polymodal Receptor)。TRPV1通道广泛存在于酵母到人类等多种物种,主要分布在脑组织和初级感觉传入神经末梢,在一些非神经组织如皮肤角质细胞、膀胱粘膜上皮细胞、胃肠道、干细胞、成纤维细胞、T细胞、肺泡壁细胞、肥大细胞和血管平滑肌细胞中也有表达,在痛觉传递和调制,整合多种疼痛信息等方面发挥重要作用。TRPV1基因敲除小鼠对热的反应明显降低甚至缺失,TRPV1阻断剂可以使动物和人的体温出现升高反应,说明TRPV1是热、痛觉感受和参与体温调节所必须的生物分子。现已明确TRPV1通道在痛觉传递和调制,整合多种疼痛信息等方面发挥重要作用。时至今日,已发现的能激活TRPV1通道蛋白的刺激物大部分是外源性的化学或物理刺激,而内源性的对TRPV1通道具有调节作用的蛋白分子尚无太多报道。由于TRPV1通道蛋白主导伤害性刺激传导,对外界伤害性刺激的感知有助于机体的自我保护,而该通道蛋白分布非常广泛,是否存在内源性的调节蛋白或配体亚基来体现其组织分布与功能的差异性,从而满足机体的多层次防护需要。我们拟对此进行探讨。为了发现内源性的对TRPV1通道蛋白有相互作用的配体分子,我们利用SMARTTM技术成功构建了小鼠背根神经节细胞(Dorsal Root Ganglion,DRG)的cDNA文库,并经文库滴度及插入片段的比对检测,证实其质量符合实验筛选的要求。以rTRPV1通道蛋白的胞内N末端(1-432aa)作为诱饵融合蛋白,和含有DRG文库的菌株进行融合培养。经过报告基因His、Ade、LacZ进行三轮筛选,共获得了120个阳性克隆,继而对所获得的阳性克隆分别进行文库质粒提取和测序分析,初步得到13种不同的文库蛋白。接着分别将所获文库质粒和诱饵质粒同时回转至酵母感受态菌株中,在SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade营养缺陷型培养基上培养进行回复性验证,证实上述筛选实验得到了8种不同的文库蛋白。我们初步从中选取了一个文库质粒,通过测序分析及NCBI网站上的序列比对,证实其为PI3K-p85β蛋白,即磷脂酰肌醇激酶-3(PI3K)的调节亚基p85β。接下来,我们分别构建了TRPV1-Nt-FLAG,TRPV1-FLAG和PI3K-p85β-GFP三种不同的表达载体,通过免疫沉淀实验证实二者在细胞内的确存在相互作用。为了进一步验证二者间的相互作用,我们分别构建了绿色和红色荧光蛋白融合表达质粒,PI3K-p85β-GFP和TRPV1-RFP,共转染HEK293细胞后,利用激光共聚焦显微技术观察,结果显示在细胞膜上能够分别观察到绿色和红色荧光信号,图片重叠后可见清晰的黄色,说明两者在细胞膜上具有共定位特性。美国华盛顿大学的Dr.Gordon研究小组在人的胎脑文库中利用酵母双杂交方法,发现PI3K-p85β和TRPV1通道具有相互作用,进一步研究发现神经生长因子(Nerve Growth Factor,NGF)和其受体trkA结合后,可以激活PI3K,活化后的PI3K通过磷酸化磷酸肌醇4,5二磷酸PI(4,5)P2而生成PI(3,4,5)P3,而PIP3可以增强TRPV1通道蛋白向细胞膜上的转运与表达,而提高TRPV1通道在细胞膜上的表达数量。为了观察我们在小鼠DRG中筛选得到的PI3K-p85β是否对TRPV1通道具有类似的调节作用,我们将TrkA、PI3K-p85β和TRPV1同时表达在HEK293T细胞中,通过全细胞膜片钳记录实验进行检测。实验中,经过100 ng/ml的NGF连续处理6 min后,统计结果显示,TRPV1通道对低浓度(0.1?M)和高浓度(1?M)的辣椒素响应均显著增强。我们的研究结果表明PI3K信号通路对TRPV1通道蛋白的功能的确具有调节作用。以上研究结果表明我们构建的小鼠DRG文库是成功的,而所建立的酵母双杂交筛选系统也可以有效地用于筛选与TRPV1通道蛋白有相互作用关系的内源性的蛋白分子。另外,本研究中所发现的其它候选克隆也为后续研究打下了良好基础。