论文部分内容阅读
红毛五加(AcanthopanaxgiraldiiHarms)是五加科植物，主要分布于我国四川、甘肃、青海、宁夏等地，为传统的祛风除湿中药，以茎皮入药。性温、味辛、入肝肾经，具有祛风除湿、通关节、强筋骨之功效，主治风寒湿痹、足膝无力等症。红毛五加含有多糖、苷类、挥发油、鞣质、维生素A、维生素B等成分。其中多糖、苷类为其主要成分，苷类主要为刺五加苷类，尤以刺五加苷E、B为多。
既往的研究证实红毛五加茎皮各种不同提取物分别具有增加冠脉流量、改善心肌能量代谢、抗心律失常、解热镇痛、镇静催眠、抗肿瘤、增强免疫力、保肝、抗病毒、抗炎等多种药理作用，而且毒性较小。以前的研究多集中在红毛五加多糖抗肿瘤等研究上，对多糖的抗肿瘤机制研究比较深入。然而，对红毛五加抗炎的研究比较少，而且停留在动物水平，对其抗炎的分子机制以及抗炎的成分研究很少。本课题组以前的研究已证实红毛五加的醇提物对小鼠腹腔巨噬细胞COX产生的PGE2有抑制作用。本研究在此基础上，应用RAW264.7细胞所产生的PGE2含量为筛选指标，对红毛五加抗炎有效成分进行了萃取、分离，得到了两个有效部分。并且初步探讨纯氯仿洗脱部分的抗炎作用机制。纯氯仿洗脱部分能够直接抑制COX-2的酶活性，而且纯氯仿洗脱部位还可以抑制致炎介质TNF-α以及NO的产生，但是不影响介质IL-10的产生。同时，我们还探讨了纯氯仿洗脱部分对OVCAR3肿瘤细胞的作用。
本实验分为三部分第一部分：红毛五加茎皮抗炎有效成分筛选目的：从红毛五加茎皮中提取、分离、筛选抗炎有效成分。
方法：1.红毛五加茎皮粉碎，95％乙醇浸渍48h，滤取提取液，重复上述操作一次，合并提取液，减压低温回收溶剂，加水溶解，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，合并正丁醇萃取部分，减压低温回收溶剂，真空低温干燥。正丁醇萃取部分干燥物用甲醇溶解，湿法加入硅胶柱，依次用溶剂系统氯仿-甲醇(含甲醇O、5％、10％、20％、30％、50％、100％)洗脱，减压低温回收溶剂，真空低温干燥。
2.以LPS刺激小鼠巨噬细胞样细胞RAW264.7，立即加入红毛五加各萃取部分、水相部分以及各分离部分共孵育24h，用放射免疫法测定细胞上清液中PGE2的含量，以能够抑制LPS刺激RAW264.7产生PGE2的作用为抗炎指标，逐步对红毛五加提取物进行筛选。
结果：1.得到白色微带棕黄色的纯氯仿洗脱部分0.3g，棕褐色的10％甲醇洗脱部分0.6g。
2.石油醚萃取部分在50mg/L剂量下不抑制细胞活性，而乙酸乙酯萃取部分、正丁醇萃取部分以及水相部分在100mg/L下不抑制细胞活性。分离部分中纯氯仿洗脱部分，20％甲醇洗脱部分在50mg/L剂量下不抑制细胞活性，其他洗脱部分在100mg/L下不抑制细胞活性。
3.RAW264.7细胞在LPS(1mg/L)刺激下产生PGE2为9.18±1.27pg/ml，正丁醇萃取部分的40mg/L以及10mg/L剂量对LPS刺激RAW264.7细胞产生PGE2为7.26±0.95pg/ml、7.43±0.82pg/ml，与LPS刺激组相比，有统计学意义(P＜0.05)，抑制率分别为23.7％、21.6％。萃取水相40mg/L剂量组对LPS刺激RAW264.7细胞产生PGE2为7.18±1.46pg/ml，与LPS刺激组相比，有统计学意义(P＜0.05)，抑制率为24.7％。而其他萃取部分各剂量组与LPS刺激组相比均无统计学意义(P＞0.05)。
4.RAW264.7细胞在LPS(1mg/L)刺激下产生PGE2为63.26±23.66pg/ml，纯氯仿洗脱部分40mg/L组PGE2为20.27±4.70pg/ml，10mg/L组PGE2为29.12±7.73pg/ml，与LPS刺激PGE2相比，有统计学意义(P＜0.01)，抑制率分别为69.6％、55.0％。10％甲醇洗脱部分40mg/L组PGE2为20.48±9.41pg/ml，10mg/L组PGE2为21.00±9.68pg/ml，与LPS刺激组PGE2相比，有统计学意义(P＜0.05)，抑制率分别为69.7％、68.4％。而其他部分各剂量组与LPS刺激组相比均无统计学意义(P＞0.05)。
结论：红毛五加抗炎的有效成分存在于其经乙醇提取，正丁醇萃取后的纯氯仿洗脱部分以及10％甲醇洗脱部分。
第二部分：红毛五加抗炎作用机制的初步研究目的：初步研究从红毛五加中筛选出的纯氯仿洗脱部分的抗炎机制。
方法：1.培养RAW264.7细胞，加入阿司匹林作用2h，抑制COX-1的表达，吸弃上清，加入新培养基，加入LPS刺激COX-2的表达20h，更换培养基，加入红毛五加纯氯仿洗脱部分，孵育15min后加入花生四烯酸，15min后立即吸取上清液，用放免法测定PGE2，以判断纯氯仿洗脱部分是否可以直接抑制COX-2的活性。
2.LPS刺激RAW264.7细胞，加入纯氯仿洗脱部分共孵育20h，酶联免疫方法测定细胞上清液中TNF-α和IL-10的含量以及硝酸还原酶法测定NO的含量。
结果：1.RAW264.7细胞在LPS(1mg/L)刺激下产生PGE2为121.68±16.95pg/ml，正常对照组产生的PGE2为40.91±9.42pg/ml，塞来昔布组产生PGE2为66.51±12.54pg/ml，与LPS刺激组相比，有统计学意义(P＜0.01)。纯氯仿洗脱部分40mg/L剂量组产生的PGE2为79.57±12.50pg/ml，与LPS刺激组相比，有显著性差异(P＜0.01)，10mg/L剂量组产生的PGE2为95.20±11.20pg/ml，与LPS刺激组相比，有统计学意义(P＜0.05)，抑制率分别为52.1％、32.8％。
2.RAW264.7细胞在LPS刺激下产生的TNF-α为530.6±15.4pg/ml，正常对照组产生的TNF-α为62.8±22.9pg/ml，DXM药物组产生的TNF-α为132..3±26.0pg/ml，与LPS刺激组相比，有统计学意义(P＜0.01)。红毛五加纯氯仿洗脱部分40mg/L剂量组产生的TNF-α为291.6±40.7pg/ml，10mg/L剂量组产生的TNF-α为358.6±37.9pg/ml，与LPS刺激组相比，有统计学意义(P＜0.01)，抑制率分别为51.0％，36.8％。
3.RAW264.7细胞LPS刺激下产生的IL-10为214.4±33.5pg/ml，干扰素(IFN)组产生的IL-10为824.7±26.6pg/ml，与LPS刺激组相比，有统计学意义(P＜0.01)。纯氯仿洗脱部分40mg/L剂量组、10mg/L剂量组、产生的IL-10分别为229.4±39.0pg/ml、243.7±47.7pg/ml，与刺激组相比，无统计学意义(P＞0.05)。
4.RAW264.7细胞在LPS刺激下产生的NO为33.7±3.6μmol，阳性药物组NO为24.3±2.9μmol，与LPS刺激组相比，有统计学意义(P＜0.01)。纯氯仿洗脱部分40mg/L剂量组NO为26.2±2.9μmol，与LPS刺激组相比，有统计学意义(P＜0.01)，氯仿洗脱部分10mg/L剂量组NO为28.3±3.2μmol，与LPS刺激组相比，有统计学意义(P＜0.05)，抑制率分别为66.0％、47.0％。
结论：红毛五加抗炎的部分机制与直接抑制COX-2的活性有关，而且可以抑制了炎症细胞产生TNF-a、NO，但不促进抑炎症因子IL-10的产生。
第三部分：红毛五加纯氯仿洗脱部分对肿瘤细胞的促凋亡作用目的：探讨纯氯仿洗脱部分是否对肿瘤细胞的生长有抑制作用。
方法：分别采用MTT法、形态学、流式细胞术方法检测纯氯仿洗脱部分对肿瘤细胞OVCAR3的促凋亡作用。
结果：MTT法可见氯仿洗脱部分对体外培养的卵巢上皮癌细胞OVCAR3的生长有抑制作用，高、低剂量组抑制率分别为20.6％、11.4％；形态学以及流式细胞术都可见氯仿洗脱部分可以促进OVCAR3凋亡。
结论：红毛五加纯氯仿洗脱部分在体外对肿瘤细胞株OVCAR3细胞有促凋亡的作用。