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研究背景多种环境刺激因素如电离辐射、高温、低氧、环境毒物、紫外线等均可诱导氧化应激。细胞通过激活复杂的DNA损伤修复反应以应对DNA双链断裂的损伤应激。DNA损伤反应包括DNA损伤的信号通路的识别,募集DNA修复因子,激活DNA的修复通路,细胞周期阻滞和凋亡。DNA双链断裂主要通过同源重组(HR)和非同源末端连接(NHEJ)两条通路修复。DNA双链断裂损伤修复依赖于一系列关键蛋白分子识别损伤位点、结合、激活下游通路等级联反应。氧化应激在导致DNA损伤的同时必定会导致生物体内蛋白质失衡,使DNA修复的相关蛋白反应异常,从而导致DNA损伤修复异常,基因组不稳,疾病的发生。构象异常的蛋白质能否重新正确折叠或及时被识别降解,即蛋白质质量控制对维持氧化应激下细胞正常的功能和存活至关重要。在蛋白质质控系统中,分子伴侣Hsp90及其共伴侣分子在协助底物蛋白的重新折叠与降解的中发挥着重要的作用。同源重组(HR)和非同源末端连接(NHEJ)通过均MRN复合物识别DNA损伤部位,MRN蛋白复合物是DNA双链断裂损伤修复通路的始动因子。MRN蛋白复合物由MRE11,NBS1,RAD50三种蛋白组装而成。MRN复合物已确定是Hsp90的底物蛋白。当Hsp90分子伴侣功能缺陷时,会导致DNA损伤修复的相关底物蛋白不稳定,那么在氧化应激刺激下,Hsp90α是否通过调控MRN复合物的活性影响DNA双链损伤修复?目的1.建立H2O2诱导的氧化应激模型并评价Hsp90α敲除对氧化应激和DNA双链损伤的影响。2.探讨氧化应激下Hsp90α是否通过调控MRN复合物活性影响DNA双链损伤修复及其具体机制。方法1.CCK-8法检测细胞活力情况。2.流式细胞仪检测细胞周期。3.单细胞凝胶电泳检测DNA双链断裂情况。4.Western Blot 检测凋亡蛋白(Caspase-3、PARP)、γ-H2AX 和 MRN 复合物的表达。5.使用PCR检测MRN复合物的mRNA水平。6.使用免疫荧光检测γ-H2AX焦点以及MRN复合物与γ-H2AX形成的焦点。结果1.在H2O2诱导的氧化应激下使细胞发生DNA双链断裂损伤,而Hsp90α敲除的HepG2细胞DNA损伤更严重。2.在H2O2诱导的氧化应激下,HepG2细胞和HepG2Hsp90α敲除细胞在500nMH2O2处理下均出现明显的细胞增殖抑制,并且Hsp90α敲除细胞更为明显。3.在H2O2诱导的氧化应激下,HepG2细胞和HepG2 Hsp90α敲除细胞在500μMH2O2处理下出现明显的G2/M期阻滞,并且Hsp90α敲除细胞的G2/M期阻滞更加严重。4.在H2O2诱导的氧化应激下,可使HepG2细胞和HepG2 Hsp90α敲除细胞发生细胞凋亡,并且Hsp90α敲除的HepG2细胞更易发生凋亡。5.MRN复合物水平在高浓度H2O2处理下减少,低浓度H2O2处理影响不大。6.Hsp90α干扰,敲除,突变株质粒的转入,抑制剂处理均可导致MRN复合物的减少,并伴随H2O2处理下DNA损伤增强及DNA修复减少。7.在500μMH2O2诱导的氧化应激下,干扰MRN复合物γ-H2AX变化不明显。8.在500μMH2O2诱导的氧化应激下,MRN复合物与γ-H2AX形成的DNA损伤修复灶点增多,但是Hsp90α敲除的HepG2细胞中MRN与γ-H2AX形成的DNA损伤修复灶点减少。结论1.H2O2诱导的氧化应激会使DNA双链发生断裂,而Hsp90α敲除的HepG2细胞DNA损伤更为严重。2.H2O2诱导的氧化应激会使细胞增殖抑制,细胞G2/M期阻滞和细胞凋亡,而Hsp90α敲除的HepG2细胞对于过氧化氢的处理更加敏感,细胞G2/M期阻滞更加严重,更容易发生细胞凋亡。3.Hsp90α干扰,敲除,突变株质粒的转入,抑制剂均可导致MRN复合物的减少,并伴随H2O2处理下DNA损伤增强及DNA修复减少。4.在H2O2诱导的氧化应激下,MRN复合物水平在高浓度H2O2下减少,低浓度H2O2处理影响不大,提示着本底MRN复合物水平对DNA损伤修复更为重要。5.在500μMH2O2诱导的氧化应激下,干扰MRN复合物γ-H2AX变化不明显,提示着MRN复合物协同其他DNA损伤修复通路共同作用,单纯的MRN复合物干扰可能上调其他DNA损伤修复因子。6.在氧化应激下,Hsp90α敲除影响MRN复合物的功能,使得识别DNA双链断裂的能力下降,DNA双链损伤修复能力下降。