眩晕是常见的临床症状之一,是因平衡系统(包括视觉、本体感觉和前庭系统)功能紊乱所导致的运动性或位置性错觉。椎-基底动脉供血不足是老年性眩晕发作的最主要的病因之一。椎基底动脉系统短暂缺血发作(vertebral-basilarartery insufficiency, VBI)指的是由于大脑后循环中血流量下降引起的一系列暂时性的临床症状,可出现一过性眩晕、视物障碍、听力下降及平衡失调等。其中,椎-基底动脉供血不足性眩晕(vertebrobasilarin sufficient vertigo, VBIV)为首要且最常见的临床表现,因其发病率高、发作急骤且病因复杂,对患者的工作及生活质量可能会产生严重的影响。因此,该疾病的诊断与治疗一直困扰着临床医生,已成为临床干预及科研研究的一个重要热点课题。目前治疗眩晕的方法虽多,但疗效欠佳。究其原因可能是眩晕的确切机制尚缺乏较为深入的阐述,尤其关于离子通道对VBIV中前庭神经神经元电生理活动的作用所知甚少。因此,进一步探讨眩晕相关的神经学发生机制是提高诊断和疗效的关键环节。前庭系统是人体平衡系统中的关键构成部分之一,其功能是处理视觉和位置的平衡。前庭神经复合核(vestibular nuclear complex, VNC)是脑干中最大的神经核,也是前庭神经系统的中继站和前庭信号的主要换元站。而在前庭神经复合核中,前庭神经内侧核(medial vestibular nucleus, MVN)因其解剖结构独特,并且具有重要的神经电生理作用,已经成为探讨与眩晕机制研究的首选核团。前庭内侧核神经元对缺氧、缺血刺激尤为敏感。然而,缺氧对前庭内侧核神经元兴奋性异常的根本的机制尚未确定。前庭系统的功能与前庭核神经元电生理特性密切相关,深入研究其电生理调控机制对阐明眩晕相关疾病的发生机理有着重要的现实意义。大电导钙激活钾通道(Big-conductance Ca2+-activated potassium channels, BKCa)具有高电导、电压依赖性强、对钙离子敏感性高以及独特的药理作用等特点,在生物系统中起到重要的作用。BKCa广泛分布于多种可兴奋性细胞中,并可呈现出阳性高表达。BKCa的功能异常可导致听力损失、高血压病、哮喘和脑部缺血等疾病的发生,并且在某些疾病中是具有潜在临床意义的药物作用靶点。BKCa是细胞膜电位的关键调控元件,可因细胞内Ca2+浓度的增加和膜电位的去极化而被激活。BKCa一个关键作用是通过改变动作电位幅度和放电频率而调控神经元的兴奋性。阻滞BKCa会导致神经元的过度兴奋,而前庭内侧核神经元可以自发性地和诱发性地诱发神经元的动作电位。激活BKCa可能发挥着一个“紧急闸”的作用：一方面,BKCa通过抑制细胞膜的去极化以及大量的Ca2+的流入而起到保护神经元的作用。另一方面,BKCa阻滞剂可能通过减少K+外流过多而发挥其神经保护作用。BKCa通道中α亚单位的结构和功能有其独有的特性,而且,BKCa的功能与α亚单位的表达关系紧密。然而,目前尚不清楚缺氧后前庭内侧核神经元的BKCa及BKCa通道α亚单位的表达。BKCa对缺氧/缺血性损伤情况下的神经细胞电生理活动也产生了关键的作用。缺氧和缺血损伤可对大脑产生危害,因它们均具有降低组织中氧的可用性的特性,这就决定了其高代谢率。已有研究报道,Na+通道、Ca2+通道、小电导Ca2+-激活K+通道(SK通道)和大电导Ca2+-激活的K+通道(BK通道)均存在于前庭内侧核神经元细胞中。但是,目前尚不是很清楚阻滞BKCa通道能否作为前庭内侧核神经元抵御缺氧性损伤的神经保护机制。因此,探讨BKCa对缺氧诱导的前庭内侧核神经元兴奋性异常的作用尤为紧迫。为了解决以上问题,我们采用全细胞膜片钳技术、半定量聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)和免疫组化技术(immunohistochemistry,IHC),探讨缺氧导致的前庭内侧核神经元神经异常放电活动以及BKCa对其缺氧导致的神经元兴奋性异常所发挥的作用。该研究将进一步为治疗椎-基底动脉供血不足性眩晕提供理论学依据,为有效防治提供新思路和药物作用的新靶点。目的本研究通过检测缺氧刺激引起的小鼠脑切片前庭内侧核神经元中神经兴奋性异常活动,以及BKCa的阻滞是否对其缺氧导致的神经元兴奋性异常产生影响。旨在探讨BKCa在前庭内侧核神经元缺氧损伤引起的神经元兴奋性异常中扮演的角色,从而阐明BKCa通道是否在缺氧前庭内侧核神经元中发挥着神经保护作用并揭示其可能的作用机制。方法本实验动物采用的是6-9周大小的雄性C57BL/6小鼠。小鼠前庭内侧核神经元置于含5%CO2～95%N2(V/V)混合气体的人工脑脊液(artificial cerebrospinal fluid, ACSF)中进行缺氧孵育,以构建小鼠前庭内侧核神经元缺氧损伤动物模型。1.运用免疫组织化学技术检测含氧量正常组与缺氧组中前庭内侧核神经元中原癌基因c-Fos的表达情况；2.运用免疫组织化学技术检测含氧量正常组与缺氧组中前庭内侧核神经元中BKCa通道α亚单位的表达情况；3.运用全细胞膜片钳方法记录缺氧刺激对前庭内侧核神经元神经细胞放电活性的影响；4.予以选择性BKCa诱导剂NS1619预处理后,采用全细胞膜片钳技术记录激活BKCa对缺氧诱导的前庭内侧核神经元放电活性的影响；5.予以BKCa通道特异性阻滞剂IBTX (iberiotoxin)预处理后,采用全细胞膜片钳技术记录在缺氧前庭内侧核神经元细胞中的总K+外向电流和BKCa电流；6.运用半定量聚合酶链反应技术检测缺氧前庭内侧核神经元中BKCa mRNA表达水平。所有数据采用SPSS17.0统计软件进行统计,以P<0.05为差异有统计学意义。结果1.缺氧前庭内侧核神经元中c-Fos蛋白的表达情况C-Fos在缺氧组(5%O2)和正常含氧量组(21%O2)前庭神经内侧神经元细胞核中均存在一定的阳性表达。在正常含氧量小鼠脑切片前庭内侧核神经元中,我们观察到神经元c-Fos阳性表达较少见。相比之下,置于缺氧ACSF孵育1h后,小鼠脑切片前庭内侧核神经元中观察到的c-Fos阳性表达显著增加(P<0.05)。2.缺氧前庭内侧核神经元中BKCa通道α亚单位的表达情况BKCa通道α亚单位在缺氧组和正常含氧量组前庭神经内侧神经元中均存在阳性表达。在正常氧量组的前庭内侧核神经元中,我们观察到大量BKCa通道α亚单位呈现出阳性表达。而且与正常含氧量组相比,缺氧孵育1h后BKCa通道a亚单位阳性细胞表达明显减少(P<0.05)。3.缺氧对前庭内侧核神经元兴奋性的影响缺氧刺激后可引起前庭内侧核神经元异常兴奋性的变化。缺氧预处理10min后,前庭内侧核神经元的放电现象首先显示增多,然后减少直至消失；与此同时,缺氧处理10min后可引起前庭内侧核神经元的静息膜电位的去极化的幅值降低。4. BKCa激活对缺氧诱导的前庭内侧核神经元兴奋性异常的影响NS1619预处理可影响缺氧刺激下诱导的前庭内侧核神经元兴奋性异常活性。予10μM NS1619预孵育2-4h后,并且置于在缺氧条件下10min后,在前庭内侧核神经元中可观察到典型的膜电位去极化的幅值降低(P<0.05)。NS1619预处理能显著延长3min缺氧刺激所致的所致神经元损伤的最大反应时间(P<0.05); NS1619预处理能减少3min缺氧条件下的神经细胞动作电位的增幅。但对缺氧10min条件下诱导的神经元的动作电位增幅没有显著的影响(P>0.05); NS1619预处理能降低缺氧10min刺激后前庭内侧核神经元细胞静息电位的去极化幅值(P<0.05),但缺氧3min刺激对的前庭内侧核神经元细胞膜电位的去极化幅值无明显影响(P>0.05)。5.缺氧前庭内侧核神经元中BKCa电流的变化与正常含氧量脑组织相比,置于缺氧ACSF孵育10min后前庭内侧核神经元中总K+外向电流显著减少(P<0.05),而且缺氧组前庭内侧核神经元中BKCa电流也显著减少(P<0.05)。6.缺氧前庭内侧核神经元中BKCa mRNA表达水平的变化与正常含氧量组相比较,置于缺氧ACSF中孵育10min后的的前庭内侧核神经元中BKCa mRNA水平显著下降(P<0.05)。结论本研究发现急性缺氧损伤后,前庭内侧核神经元神经元兴奋性异常活动增加,而且,阻滞BKCa通道可引起缺氧后前庭内侧核神经元兴奋性异常的暂时性增强。这些结果提示,BKCa通道可能在眩晕患者前庭神经内侧核抵御缺氧损伤中扮演了一个重要的神经保护角色,可能作为一个潜在地治疗VBI引起的眩晕发作、听力损失的作用靶点。该研究将进一步为临床有效防治提供新的思路和药物作用的新靶点。