论文部分内容阅读
先天免疫系统是脊椎动物抵御病原体的第一道防线。入侵脊椎动物的病原由先天性免疫系统通过各种模式识别受体(pattern recognition receptors,PRRs)来进行识别,被模式识别受体识别的病原结构称为病原体相关分子模式(pathogenassociated molecular patterns,PAMP),如细菌的脂多糖和病毒的双链RNA等。模式识别受体识别病原之后通过下游的信号传导途径激活相关免疫细胞,诱导免疫细胞参与炎症及各类免疫应答。Toll样受体(Toll-like receptors,TLR)是脊椎动物重要的模式识别受体之一,根据Toll样受体类型可识别细菌的脂多糖,病毒的双链RNA,细菌鞭毛等各种病原体相关分子模式。Toll样受体识别相应病原后通过与下游MyD88,TRIF等衔接分子结合的方式进行信号传导并激活NF-kB,IRF等重要转录因子,从而诱导炎性细胞因子和干扰素的产生,产生先天免疫应答。东北七鳃鳗(Lethenteron morii)属于圆口纲动物,是最原始的脊椎动物之一。为探究先天免疫系统中Toll样受体及其介导的信号通路的起源和进化,我们对东北七鳃鳗TLR信号通路相关分子作了鉴定并进行了初步功能研究。本研究利用聚合酶链式反应技术克隆了东北七鳃鳗Toll样受体家族成员TLR3(LmTLR3)及其衔接分子TRIF(Lm TRIF)的cds序列;通过生物信息学方法鉴定分析了LmTLR3与Lm TRIF的cds序列,通过实时荧光定量PCR方法对LmTLR3及Lm TRIF进行了初步组织表达分析;构建了LmTLR3及其相关结构域、Lm TRIF的真核表达载体;通过细胞免疫荧光实验探究了LmTLR3及Lm TRIF的表达定位。为了研究TLR3参与的免疫应答功能,利用双荧光素酶报告基因的方法验证了东北七鳃鳗NF-kB(Lm NF-kB)启动子报告基因的活性,并探究了LmTLR3及其衔接分子Lm TRIF与Lm NF-kB的关系。此外,作为对比,还验证了东北七鳃鳗TLR1亚家族成员(Lm TLR 2d,Lm TLR 14d)及其衔接分子MyD88(Lm MyD88)与Lm NF-kB的关系。现取得结果如下:1.东北七鳃鳗TLR3的克隆鉴定、组织表达及亚细胞定位LmTLR3 cds序列全长2670bp,编码889aa,相对分子质量99.46 k D,理论等电点为6.92。LmTLR3氨基酸序列包含1个信号肽,13个LRR结构域,1个跨膜结构域和1个TIR结构域。多序列比对结果结果显示,LmTLR3 TIR结构域中包含3个保守区域。系统进化树显示,哺乳类TLR3与爬行类TLR3聚为一支,它们再与硬骨鱼类TLR3聚为一支,最后与东北七鳃鳗TLR3聚为一大支。东北七鳃鳗的TLR3氨基酸序列位于脊椎动物TLR3与无脊椎动物TLR3之间。初步实时荧光定量PCR检测结果显示,LmTLR3在皮肤中的相对表达量最高,而在肝脏,脑,肠,鳃中的相对表达量较高。细胞免疫荧光实验结果显示,LmTLR3能在HEK293T细胞中表达,且TLR3定位于细胞内且主要分布在细胞核周围,而TLR3 LRR截短蛋白广泛分布于细胞质中。2.东北七鳃鳗TLR3衔接分子TRIF的克隆鉴定、组织表达及亚细胞定位Lm TRIF cds序列全长1242bp,编码413aa,相对分子质量46.99 k D,理论等电点为6.21。Lm TRIF氨基酸序列包含1个TIR结构域,没有典型TRIF的N端结构域。系统进化树显示,哺乳类TRIF与鸟类、爬行类TRIF聚为一支,然后它们再与硬骨鱼类TRIF聚为一支,最后与东北七鳃鳗TRIF聚为一大支,东北七鳃鳗TRIF与硬骨鱼类TRIF同源性最高。初步实时荧光定量PCR检测结果显示,Lm TRIF在鳃中的相对表达量最高,而在肠,脑,皮肤中相对表达量较高。细胞免疫荧光实验结果显示,Lm TRIF能在HEK293T细胞中表达,且广泛分布于细胞质中。同时Lm TRIF能在EPC细胞中表达,且以聚集的形式分布在细胞质中。3.东北七鳃鳗NF-kB启动子报告基因活性验证Lm NF-kB启动子序列包含CREB、Oct-1、GATA-1、AP-1、NF-kappa B、IRF-1、Sp-1、c-Jun和c-Fos等多个转录因子结合位点,并包含TATA box转录核心元件。序列1207-1402 bp处存在CG含量大于50%,长196 bp的Cp G岛。经双荧光素酶报告基因系统检测,在HEK293T和EPC细胞中Lm NF-kB启动子报告基因较对照组空载质粒有极显著活性。且在LPS刺激HEK293T细胞后,Lm NF-kB启动子报告基因较未经LPS刺激的Lm NF-kB启动子报告基因有极显著活性。4.东北七鳃鳗TLR3及其衔接分子TRIF与NF-kB的关系双荧光素酶报告基因检测实验结果显示,瞬时转染Lm TRIF可以极显著激活Lm NF-kB启动子活性。在过表达TRIF的前提下,加入LmTLR3共同转染后,随着TLR3加入量的增加,下游NF-kB活性逐渐降低,但与不加TLR3的对照组相比无显著差异。5.东北七鳃鳗TLR信号通路衔接分子MyD88的鉴定及亚细胞定位Lm MyD88基因cds序列由本实验室先前克隆得到,它编码的氨基酸序列包含MyD88蛋白的典型结构域:N端的死亡结构域和C端的TIR结构域,并包含三个死亡结构域保守位点和三个TIR结构域保守区域。多序列比对结果显示Lm MyD88氨基酸序列与其他脊椎动物相比相似性在47%-54%之间,其中DD结构域的相似性是42%-51%,TIR结构域的相似性是61%-66%。系统进化树结果显示哺乳类、鸟类、爬行类和两栖类MyD88聚为一支,硬骨鱼类MyD88聚为一支,七鳃鳗和其他脊椎动物MyD88聚为一大支。与此同时,硬骨鱼类和七鳃鳗MyD88具有较高的同源性。东北七鳃鳗MyD88在系统进化树中的位置介于脊椎动物和无脊椎动物之间。细胞免疫荧光实验结果显示,Lm MyD88以聚集的形态在HEK293T细胞核和细胞质中表达。虽然Lm MyD88与线粒体和内质网的标记重叠,但它与这些标记并没有特异性的共定位。6.东北七鳃鳗TLR1亚家族成员及衔接分子MyD88与NF-kB的关系双荧光素酶报告基因检测结果显示,过表达Lm MyD88可以显著促进NF-kB启动子报告基因活性;东北七鳃鳗TLR1亚家族成员Lm TLR 2d的LRR结构域对Lm NF-kB启动子的活性有显著促进作用,Lm TLR 2d和Lm TLR 2d TIR结构域对Lm NF-kB启动子的活性没有显著影响;Lm TLR 2d,Lm TLR 2d LRR结构域,Lm TLR2d TIR结构域和Lm MyD88共同转染组较它们各自的单独转染组对Lm NF-kB启动子的活性均有显著促进作用,这些共同转染组相较Lm MyD88单独转染组对Lm NF-kB启动子的活性有一定促进作用;单独转染东北七鳃鳗Lm TLR 14d,Lm TLR 14d TIR结构域,Lm TLR 14d LRRCT结构域对Lm NF-kB启动子的活性均没有显著影响,当它们分别与Lm MyD88共同转染后,相较它们各自的单独转染组对Lm NF-kB启动子的活性有极显著促进作用;Lm TLR 14d和Lm TLR 14d LRRCT结构域与Lm MyD88共同转染组较Lm MyD88单独转染组对Lm NF-kB启动子的活性有显著促进作用。综上所述,本研究首次鉴定了东北七鳃鳗LmTLR3及其衔接分子Lm TRIF,其中LmTLR3具有保守的结构域及位点,Lm TRIF缺乏N端经典结构域,在序列上具有一定特异性;研究表明LmTLR3及其衔接分子Lm TRIF能在细胞中表达,且均定位在细胞质中。本研究验证了东北七鳃鳗Lm NF-kB启动子报告基因的活性,并发现东北七鳃鳗的LmTLR3能通过接头蛋白Lm TRIF促进Lm NF-kB的转录活性。此外,鉴定了东北七鳃鳗TLR信号通路另一重要衔接分子Lm MyD88具有保守的结构域及功能位点,且能以与其他脊椎动物MyD88相似的形态在细胞中表达,并能促进下游免疫转录因子Lm NF-kB活性,本研究还发现东北七鳃鳗TLR1亚家族成员Lm TLR 2d,Lm TLR 14d与Lm MyD88可能存在协同作用以激活Lm NF-kB。本研究探究了东北七鳃鳗TLR3信号通路相关分子的特征及相互关系,作为对比,并对TLR1是否通过MyD88衔接分子激活NF-kB的功能进行初步研究,为原始脊椎动物先天免疫系统的研究奠定了一定基础。