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骨骼肌(skeletal muscle)是机体至关重要的组织,它的形成与更新发生在胚胎及出生后生长发育的任一阶段。骨骼肌分化进程受到转录因子paired-box家族Pax蛋白、肌生成调节因子(myogenic regulatory factors)MRFs蛋白和肌细胞增强因子2(Myocyte enhancer factor-2)家族MEF2蛋白的严格调控。骨骼肌分化异常导致各种肌肉相关疾病如横纹肌肉瘤、肌萎缩、杜氏肌营养不良症、重症肌无力等的发生,因此研究骨骼肌的分化机制具有重大的意义。
除转录调控外,表观遗传调控在骨骼肌分化的过程中也发挥着不可或缺的作用。各种表观修饰酶介导的蛋白质翻译后修饰伴随着骨骼肌分化的各个时期,对骨骼肌的分化起着必要的调控作用。最近的研究发现,组氨酸甲基转移酶SETD3可以修饰?-Actin蛋白上的组氨酸,调节其成纤维的聚合和解聚能力,从而影响子宫肌层的收缩。敲除Setd3的小鼠出现难产表型。另外有研究发现,SETD3在骨骼肌组织中高表达,且它在小鼠肌原细胞C2C12分化进程中表达量增加,在促骨骼肌分化中发挥作用。另一方面,有大量研究表明,许多miRNAs受到肌调节因子和肌细胞增强因子2的调节,并通过靶向多种肌分化基因特异性调控骨骼肌分化进程。但是,SETD3在C2C12细胞分化中的精细调控机制尚不清楚。
我的研究发现,SETD3确实具有促骨骼肌分化功能,在C2C12细胞中敲低Setd3基因抑制该细胞的定向分化。通过软件预测、构建荧光素酶报告系统、细胞水平过表达或敲低miRNAs等方法,我发现miR-15b和miR-322可以直接靶向结合在Setd3基因的3’-UTR区域,抑制Setd3表达,从而控制细胞分化进程。敲除这两个miRNAs或者转入其对应的抑制剂,Setd3表达水平升高,促进了细胞分化。进一步,发现miR-15b受到转录因子E2F1正调控。在分化过程中,E2f1表达量下降,miR-15b表达随之下降,诱导Setd3表达升高,促进分化。而miR-322受到FAM3B的负调控。FAM3B直接结合到miR-322的启动子区域,抑制miR-322表达。在分化过程中,FAM3B表达逐渐升高,miR-322受到抑制,Setd3表达升高,促进细胞分化。再进一步,我探索SETD3在横纹肌肉瘤中是否具有促进分化、抑制增殖的作用。结果发现,过表达SETD3促进该细胞的增殖。有趣地是,在宫颈癌HeLaS3细胞系中,SETD3可促进细胞衰老形成多核巨细胞。以上两个表型均依赖SETD3的酶活性。自此,在细胞水平上,发现SETD3分别具有促进成肌细胞分化、横纹肌肉瘤细胞增殖和HeLaS3细胞衰老的多重功能。在小鼠个体水平,意外发现,高脂喂养Setd3敲除小鼠会引起小鼠脱毛和皮肤溃烂。而通过检测脾脏表型和小鼠血液总IgG含量,我的初步结果显示这一表型可能与免疫炎症的发生无关。
综上所述,我验证了SETD3促进骨骼肌分化的作用,发现了靶向调控Setd3的miR-15b和miR-322,并揭示了调控这两个miRNA的转录因子E2F1和FAM3B。最终我阐明了两个“转录因子-miRNA-甲基转移酶”调控通路,为治疗肌肉分化异常引起的疾病提供了新的研究思路。此外,我发现了SETD3促进细胞增殖和衰老的功能。在动物水平,我还发现在高脂喂养条件下Setd3敲除小鼠出现皮肤溃烂的表型。以上研究揭示了SETD3蛋白在骨骼肌分化与肿瘤发生等生命活动中发挥多种功能,阐明了SETD3发挥调控功能的分子机制,为骨骼肌相关疾病的治疗提供了基础理论依据。
除转录调控外,表观遗传调控在骨骼肌分化的过程中也发挥着不可或缺的作用。各种表观修饰酶介导的蛋白质翻译后修饰伴随着骨骼肌分化的各个时期,对骨骼肌的分化起着必要的调控作用。最近的研究发现,组氨酸甲基转移酶SETD3可以修饰?-Actin蛋白上的组氨酸,调节其成纤维的聚合和解聚能力,从而影响子宫肌层的收缩。敲除Setd3的小鼠出现难产表型。另外有研究发现,SETD3在骨骼肌组织中高表达,且它在小鼠肌原细胞C2C12分化进程中表达量增加,在促骨骼肌分化中发挥作用。另一方面,有大量研究表明,许多miRNAs受到肌调节因子和肌细胞增强因子2的调节,并通过靶向多种肌分化基因特异性调控骨骼肌分化进程。但是,SETD3在C2C12细胞分化中的精细调控机制尚不清楚。
我的研究发现,SETD3确实具有促骨骼肌分化功能,在C2C12细胞中敲低Setd3基因抑制该细胞的定向分化。通过软件预测、构建荧光素酶报告系统、细胞水平过表达或敲低miRNAs等方法,我发现miR-15b和miR-322可以直接靶向结合在Setd3基因的3’-UTR区域,抑制Setd3表达,从而控制细胞分化进程。敲除这两个miRNAs或者转入其对应的抑制剂,Setd3表达水平升高,促进了细胞分化。进一步,发现miR-15b受到转录因子E2F1正调控。在分化过程中,E2f1表达量下降,miR-15b表达随之下降,诱导Setd3表达升高,促进分化。而miR-322受到FAM3B的负调控。FAM3B直接结合到miR-322的启动子区域,抑制miR-322表达。在分化过程中,FAM3B表达逐渐升高,miR-322受到抑制,Setd3表达升高,促进细胞分化。再进一步,我探索SETD3在横纹肌肉瘤中是否具有促进分化、抑制增殖的作用。结果发现,过表达SETD3促进该细胞的增殖。有趣地是,在宫颈癌HeLaS3细胞系中,SETD3可促进细胞衰老形成多核巨细胞。以上两个表型均依赖SETD3的酶活性。自此,在细胞水平上,发现SETD3分别具有促进成肌细胞分化、横纹肌肉瘤细胞增殖和HeLaS3细胞衰老的多重功能。在小鼠个体水平,意外发现,高脂喂养Setd3敲除小鼠会引起小鼠脱毛和皮肤溃烂。而通过检测脾脏表型和小鼠血液总IgG含量,我的初步结果显示这一表型可能与免疫炎症的发生无关。
综上所述,我验证了SETD3促进骨骼肌分化的作用,发现了靶向调控Setd3的miR-15b和miR-322,并揭示了调控这两个miRNA的转录因子E2F1和FAM3B。最终我阐明了两个“转录因子-miRNA-甲基转移酶”调控通路,为治疗肌肉分化异常引起的疾病提供了新的研究思路。此外,我发现了SETD3促进细胞增殖和衰老的功能。在动物水平,我还发现在高脂喂养条件下Setd3敲除小鼠出现皮肤溃烂的表型。以上研究揭示了SETD3蛋白在骨骼肌分化与肿瘤发生等生命活动中发挥多种功能,阐明了SETD3发挥调控功能的分子机制,为骨骼肌相关疾病的治疗提供了基础理论依据。