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目的：本研究建立细胞3D培养方法以分离和鉴定肺癌类干细胞,并与2D培养方法比较,初步探讨该方法在评价肺癌体外增殖、凋亡、侵袭和药物反应性方面的应用。方法：1.3D细胞培养方法的建立将人肺腺癌细胞系A549以104个/孔的细胞与RPMI1640和BME为基础的培养基制成细胞悬液,培养7天,用分散酶和回收液消化并将细胞回收传代,进行类干细胞筛选,收集细胞进行流式细胞仪检测干细胞表型。收集各组培养3、7、11、14、20天的细胞,分别制成细胞悬液,调整细胞浓度为1×105个细胞/100μ1,分别用抗体标记物(CD44、CD326、CD24)标记,同时标记FITC-IgG2b、 APC-IgG1、PE-IgG1作为对照进行流式细胞仪免疫表型检测。2.肺癌干细胞功能检测将3D培养的A549细胞进行体外成球、耐药性、体内成瘤及类干细胞鉴定,并与2D培养的细胞进行比较。将各组培养的细胞以5000个/3ml MFM的密度接种到6孔板中,7天后观察细胞的成球率。分别接种数目为5×104个细胞／只接种到SCID裸鼠体内,每组4只。每三天测量瘤块大小,并绘制生长曲线。并且利用Matrigel和Transwell构建侵袭小室进行高侵袭性和低侵袭性细胞群的分离,利用划痕修复实验检测细胞迁移能力。通过实时定量PCR检测两组肺癌干细胞相关基因表达水平的变化。3.3D细胞培养在抗癌药药效学方面的应用再将两组培养的A549细胞通过MTT检测各组细胞的顺铂耐药性的变化,并通过Western blot检测两组肺癌类干细胞相关蛋白表达水平的变化。结果：1.3D细胞培养方法的建立经过3D培养的细胞转入2D培养系统后其增长速率逐渐增快,并显著高于2D培养的细胞,细胞表型检测证明3D培养的A549细胞中CD44和CD326阳性比例升高,CD24阳性比例下降。2.肺癌干细胞功能检测3D培养的细胞体外成球率显著升高(28.50±1.17%vs8.67±0.80%,P<0.01),体内成瘤时间显著缩短(20.75±0.85d vs60.25±1.49d,P<0.01)。侵袭能力和划痕修复能力增强(125.67±6.028vs64.67±11.37,83.75±5.84%vs35.63±3.05%,P<0.01),3D培养的干细胞相关基因表达显著高于2D。3.3D细胞培养在抗癌药药效学方面的应用在两种培养中分别加入不同浓度的顺铂和培美曲塞两种肿瘤药物发现,3D培养的细胞对顺铂耐药性显著提高(58.17±2.19%vs33.27±5.76%in48h,P<0.01),(41.70±5.81%vs27.30±4.25%in72h,P<0.01),加药后β-catenin蛋白的表达远远高于2D培养的细胞加药后的表达。结合MTT检测得出顺铂和培美曲塞对经过3D培养的A549细胞的半数抑制浓度IC50分别为6.58±1.25μg/ml和7.86±1.60μg/ml。结论：3D培养的肺癌细胞中得到了更高比例的类干细胞样细胞,具有体内成瘤快、体外成球率高、耐药性提高、侵袭能力和迁移能力增强的特征。利用3D培养方法分离人肺腺癌细胞系A549中的类干细胞,证明其比2D培养的A549细胞系具有更强的增殖能力,更低的凋亡,更高的转移潜能以及更差的药物反应性,并且干细胞的蛋白表达量明显增加,药物半量抑制浓度也大大提高,肺癌类干细胞耐药性明显增强。