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最近的研究表明,从骨髓间充质干细胞分离得到几类具有多能性的干细胞类群,这些多能干细胞,不仅具有自我更新和多向分化能力,还能在机体受到压力,如组织损伤时,能够快速增殖和分化,进而修复受损组织。胰蛋白酶是细胞培养中经常使用的一种消化能力特别强,价格低廉的内切酶。长时间胰酶消化容易过度破坏细胞膜表面的膜蛋白引起细胞损伤,诱发细胞凋亡。一般消化细胞时间不宜过长,但是,日本的研究小组最近从经过长时间胰酶处理的成纤维细胞和间充质中发现并分离了Muse细胞,这类细胞高表达多能性的相关标记,能向三胚层细胞分化。目前,关于长时间胰酶消化处理间充质干细胞的生物特性方面的报道很少。实验证明,骨髓间充质干细胞经长时间胰酶处理(Long Time Trypsin-treat)后,除了有利于富集成体细胞中的多能干细胞,存活下来的细胞,还具有比较强的压力耐受性。鉴于当前转基因动物生产、iPS诱导等对供体细胞在增殖能力、多能性、压力容受性、细胞活性等方面的要求越来越高,对长时间胰酶处理后细胞生物特性的研究非常有必要。本实验通过全贴壁培养的方法从牛胎儿骨髓中分离得到骨髓间充质干细胞,经过流式细胞检测和诱导分化实验对其进行了鉴定;通过0.25%胰酶对牛胎儿骨髓间充质干细胞(BMSCs)进行10 h消化处理,然后进行形态观察、生长曲线绘制、AP染色、定量PCR、免疫荧光染色等分析消化后细胞(LTT-BMSCs)的生物特性,发现长时间胰酶消化有助于富集体积小的细胞、上调干性基因表达等;最后,分别用含0 ng/ml、10 ng/ml、20 ng/ml、40 ng/ml碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的培养液培养LTT-BMSCs,探究bFGF对LTT-BMSCs干性基因表达和增殖的影响。本实验为深入了解LTT法对骨髓间充质干细胞生物特性影响奠定了基础。1.牛胎儿骨髓间充质干细胞的分离培养与鉴定本实验,通过全骨髓贴壁法,成功从牛胎儿骨髓中分离得到骨髓间充质干细胞;通过免疫荧光染色、碱性磷酸酶染色、流式细胞仪检测细胞表面标记进行鉴定,表明分离得到的细胞为骨髓间充质干细胞,其中,骨髓间充质干细胞的CD105、CD90、CD73阳性表达量分别高达97.4%、84.1%、91.4%,阴性表达CD34表达量为3.5%;免疫荧光染色、诱导分化实验的结果,证明牛骨髓间充质干细胞的多能性。2.长时间胰酶处理(LTT)对骨髓间充质干细胞生物特性影响的研究首先,用0.25%胰酶对骨髓间充质干细胞进行不同时间的处理,通过定量PCR、细胞计数筛选出对提高干性基因表达最有利的处理时间;对骨髓间充质干细胞进行10 h的消化处理,通过形态观察、生长曲线、碱性磷酸酶染色、免疫荧光染色、定量PCR、Brdu染色、核型分析对LTT-BMSCs的生物特性进行研究,发现LTT法有助于骨髓间充质干细胞中体积较小细胞的富集,能够提高多能基因的相对表达量,促进细胞的增殖;用不同bFGF浓度的培养液,对较高代次的LTT-BMSCs进行培养,通过生长曲线、碱性磷酸酶染得、定量PCR、免疫荧光染色及Western Blot确定20 ng/ml的bFGF有利于LTT-BMSCs的增殖和干性基因表达的维持。