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木质纤维素是一种重要的生物质能,将木质纤维素转化为燃料乙醇是缓解能源危机的新思路,而纤维素酶是木质纤维素转化为燃料的关键因素。然而在实际的工业生产中,许多制约因素存在于纤维素酶的应用。其中最主要的因素是纤维素酶的比活力低下。因此,对现有纤维酶进行蛋白质工程改造已成为当前研究的热点。在本研究中,对一个内切葡聚糖酶I(EG Ⅰ)进行了热稳定性的定向进化,增强了其热稳定性,实验结果如下：一、通过逆转录PCR,从一株长枝木霉(T. longibrachiatum A002) 的 mRNA中,克隆了其内切葡聚糖酶I(EG Ⅰ)的成熟肽段编码序列(eg Ⅰ CDS),该CDS长1386 bps。信息学分析显示该序列编码一个含461个氨基酸残基的亲水性蛋白质,并携带信号肽编码序列,预测其分子量为48 KD,并具有多个潜在O-糖基化位点。相似性分析显示该CDS与众多来自木霉属的EG Ⅰ序列具有较高的相似性。保守结构域分析显示该内切酶存在GH 7(糖苷水解酶家族)及CBM 1(碳水化合物结合结构域家族)两个保守结构域。三级结构预测显示该蛋白质催化中心为果冻状卷饼(β-jelly roll)结构,催化位点为218 E、223 E。二、利用载体pPIC9K,将该基因于毕赤氏酵母中进行了异源分泌表达。在培养物上清中检测到羧甲基纤维素酶活性(CMCase),并通过SDS-PAGE分离得到一条约48 KD的蛋白质条带。该重组蛋白的最适作用温度为45℃,最适作用pH为5.0。对该内切酶的诱导表达条件进行了优化,结果显示最适诱导时间为168 h,上清中的羧甲基纤维素酶活性可达12.9 U/mL；最适诱导甲醇浓度为1.0%,上清中的羧甲基纤维素酶活性可达15.5 U/mL。三、通过易错PCR与DNA改组,对egⅠ CDS进行了随机突变,并构建了突变文库,进而对EG Ⅰ的热稳定性进行定向进化。从5400个突变体中,筛选得到了一个突变酶Mut A19。该突变酶的热稳定性较野生型得到了增强。其最适作用温度为65℃,较野生型提高了20℃。45-C时突变酶与野生酶均可保持活力的稳定；65℃时野生酶则迅速失去活力,而突变酶在60 min内仍可保持活力的稳定。综上所述,在本研究中,克隆了一个长枝木霉的内切葡聚糖酶Ⅰ成熟肽编码序列并于毕赤氏酵母中进行了分泌表达。建立了一套合适的随机突变与DNA改组的方法并通过定向进化得到了一个最适作用温度提高且热稳定性得到增强的突变酶。