抗生素的发现与临床应用使很多危害人类的感染性疾病得到控制，对提高人们的生活质量起到重要的作用。但随着抗生素的广泛使用，抗生素滥用不可避免地在全世界范围内发生，由此导致细菌的耐药性出现，并日益严重，直接威胁到人类的生命健康。因此，阐明细菌耐药感染机制对耐药菌的控制具有十分重要的意义。在目前己知的4个抗生素耐药机制中，膜通透性与外排泵系统机制是与多重耐药相关的2个重要因素。膜通透性降低可以阻止抗生素进入，外排泵的启动则将胞内抗生素外排到胞外。革兰氏阴性细菌外膜蛋白是细胞膜通透性与外排泵系统的直接承担者，在细菌耐药中具有重要的作用，因此研究其在耐药中的调控与机制具有重要的意义。 本试验首先采用功能蛋白质组学技术，以对具有代表性的6种抗生素：萘啶酮酸(NA，第一代喹诺酮类)、金霉素(CTC，第一代四环素类)、巴洛沙星和环丙沙星(BLFX，CFLX，第三代氟喹诺酮类)、头孢他啶和头孢曲松钠(CTRX，CAZ，第三代头孢菌素类)的大肠埃希氏菌传代耐药菌株为研究对象，对这6种传代耐药菌株外膜差异蛋白进行了较系统的鉴定和较深入的比较分析。结果发现，与这些细菌耐药相关外膜蛋白为TolC、LamB、OmpC、OmpF、OmpT、FadL、OmpW、FhuA、FecA、Ag43和YaeT等11个，这些变化蛋白在不同的抗生素传代耐药菌中的变化并不一样。其中LamB在金霉素、环丙沙星、头孢他啶和头孢曲松钠传代耐药菌中表达下调，FecA在环丙沙星、巴洛沙星、头孢他啶和头孢曲松钠传代耐药菌中表达下调，FhuA在头孢曲松钠传达耐药菌中表达下调，FadL在金霉素和萘啶酮酸传代耐药菌中表达下调，Ag43在环丙沙星和头孢曲松钠传代耐药菌中表达下调，YaeT在头孢曲松钠传代耐药菌中表达下调。OmpF、OmpC、TolC、OmpT和OmpW在不同抗生素耐药中的表达不一样，其中OmpF在环丙沙星和头孢他啶中表达下调，而在头孢曲松钠传代耐药菌中表达升高，OmpC在萘啶酮酸传代耐药菌株中表达升高、但在金霉素、头孢他啶和头孢曲松钠传代耐药菌中表达下调，TolC在头孢曲松钠传代耐药菌中表达下调，而在其它抗生素耐药传代菌中表达上调，OmpT在萘啶酮酸代耐药菌中表达上调，而在金霉素和头孢曲松钠耐药传代菌中表达下调。OmpW在萘啶酮酸传代耐药菌中表达上调，而在金霉素、环丙沙星和头孢他啶传代耐药菌中表达下调。 这些变化的外膜蛋白中，Ag43、YaeT和FecA在耐药中的变化以前未见报道，是本试验新报道的与耐药相关蛋白。TolC、OmpC、OmpF、LanB、OmpT、FadL和FhuA在抗生素中表达变化已有文献报道，但是TolC在以往文献中的报道都是表达上升，而在本试验中，首次发现TolC的蛋白修饰点在不同抗生素耐药中的变化不一样，并首次报道在头孢曲松钠传代耐药菌中表达下调。OmpC在以往文献中的报道都是表达下降，而在本试验中，首次发现OmpC在萘啶酮酸传代耐药菌中表达上升。在不同细菌耐药中，文献报道LamB的表达变化不一样，而在本试验中，LamB在金霉素、环丙沙星、头孢他啶和头孢曲松钠传代耐药菌中表达都是下调。FadL和文献报道的变化一致，都是下调。OmpT和OmpW在以往的报道中表达变化不一致，在本试验中，OmpT和OmpW的变化在不同抗生素传代耐药菌中的表达也不一样。关于FhuA的文献报道并没有谈及耐药中该蛋白的表达情况，在本试验中，FhuA的表达下降，与预测的变化一致。 接下来以金霉素和萘啶酮酸为例，通过其耐药相关的外膜蛋白缺失菌株对在不同金霉素和萘啶酮酸浓度下生存率试验，比较这些外膜蛋白在细菌耐药中的作用。结果发现，TolC、OmpC、OmpF和LamB在萘啶酮酸和金霉素耐药中起重要作用。进一步比较这4种缺失菌株对其他4种抗生素中的生存率的影响，结果发现，作为多重耐药的通用外排泵蛋白TolC对头孢类抗生素不起作用，LamB在抗生素耐药中起重要的负调作用，OmpC和OmpF的表达变化涉及到不同的调控系统，与抗生素的种类有关。 接下来对在耐药中具有重要功能的LamB和OmpC与OmpF的耐药机理与调节机制进行较深入的研究： (1)已知OmpC与OmpF受双组分调控系统OmpR/EnvZ和CpxA/CpxR的调节，但其在细菌耐药中的调节方式还不清楚。本实验首先通过Western blotting方法比较分析在萘啶酮酸和金霉素作用下，OmpC与OmpF在这2个双组分调控系统的基因缺失菌株中表达的差异。结果发现，在金霉素作用下，OmpR/EnvZ与CpxR/CpxA都对OmpC与OmpF起调控的作用，但是主要是以CpxR/CpxA系统为主。在萘啶酮酸作用下，OmpC与OmpF的变化主要受OmpR/EnvZ系统的调控，CpxA可能对OmpR具有交叉调控的作用。然后利用双向电泳技术分析OmpR/EnvZ和CpxR/CpxA缺失菌株在高浓度金霉素和萘啶酮酸作用下，细菌外膜蛋白的变化情况。结果发现有18个表达差异蛋白，其中有14个是外膜蛋白(YaeT、FecA、TolC、OmpT、OmpC、FhuA、Ag43、NmpC、OmpW、FliC、ButB、OmpF、PhoE和OmpA)，这14个外膜蛋白中有9个是在6种抗生素传代耐药菌株发生变化的外膜蛋白(TolC、FecA、FhuA，OmpW、YaeT、OmpF、OmpC、OmpT和Ag43)，5个外膜蛋白(OmpA、NmpC、FliC、PhoE和ButB)是新发现的差异蛋白。这些蛋白在抗生素作用下的表达变化，很可能形成蛋白相互作用的网络，是对耐药重要蛋白OmpC和OmpF变化的补偿。最后，利用蛋白相互作用分析软件，建立表达差异的外膜蛋白之间相互变化网络，结果发现，缺失ompR后蛋白的变化以正调控为主，而缺失cpxA后，外膜蛋白的变化主要以负调控为主。这两个双调节系统对两种抗生素的调节差别可能主要在于，通过CpxR对AtpB的调节不同而影响OmpC的变化，从而构成耐药调节的网络差异。认识这些耐药相关外膜蛋白在不同抗生素中的变化方式，对指导临床用药具有重要的意义。 (2)为研究LamB在细菌耐药中的功能及其耐药机制，本试验首先通过荧光光度法研究缺失lamB菌株在金霉素中的积聚。结果发现，缺失lamB导致金霉素浓度在细菌体内积聚的降低，提示LamB很可能起抗生素通道的功能。然后利用Western blotting以及Co—IP试验寻找LamB的相互作用蛋白并分析其在细菌耐药中的表现，结果发现，LamB与丙酮酸脱氢酶复合体(PDHc)中的E1酶部分Odp1形成复合物，并且LamB—Odp1复合物随着耐药细菌的抗性增强而降低，这提示LamB—Odp1介导的细菌耐药与细菌能量系统相关。随后利用Western blotting及在金霉素中生存率变化的方法筛选与LamB表达相关的双组分调节系统，试验发现，LamB的表达受BasS/BasR、BarA/UvrY和BaeS/BaeR的调控，△ basS与△ uvrY在金霉素作用下的生存率升高，提示双组分调节系统调节LamB的表达，并与细菌耐药过程相关。进一步通过双向电泳的方法比较缺失lamB菌株在金霉素作用下蛋白的表达差异，结果发现，lamB的缺失在金霉素作用下导致AtpA、AtpB、PtnaB、TolB、MalK、YncD、EftU、PhsA和ButB的变化，它们涉及生长因子、大肠杆菌素、能量系统和糖转运系统的变化，提示与LamB相关的细菌耐药过程涉及广泛的细菌体内多个能量及代谢调节网络系统。最后通过Western blotting的方法分析LamB在临床耐药菌株中的表达，结果发现，至少有60％的临床耐药菌株中LamB发生明显的下降，因此LamB在耐药中的负调是普遍的现象。根据对LamB的耐药功能及其耐药机制的研究，提示LamB介导的细菌耐药途径是一个新的耐药机制。 通过以上的研究，为进一步研究细菌耐药机制做出了初步的探索。