随着我国经济的飞速发展,我国人民的饮食结构也较前有了巨大的改变,且由于西方国家的饮食习惯的影响,我国近年来对可乐、快餐等高脂高热量的食物消耗量明显上升。流行病学资料显示,非酒精性脂肪肝(non-alcohol fatty liver disease,NAFLD)的发病率大幅攀升。NAFLD目前已成为多数西方国家的第一大慢性肝脏疾病。NAFLD的病变特点多呈一个连续发展的疾病谱,其病变的早期,具有可逆性的特点,如何针对NAFLD的发病机理进行研究,进而逆转NAFLD的连续发展疾病谱,是目前医务工作人员防治代谢性疾病的重点和难点。根据我国2010版非酒精性脂肪性肝病诊疗指南,NAFLD的患病人群,其肝脏的病理特征为混合性的肝细胞脂肪变,可以伴有或不伴有炎症细胞的浸润以及窦周的纤维化,并且NAFLD的患者既往无饮酒史或饮酒折合乙醇量小于140g/周(女性小于70g/周)。NAFLD与胰岛素抵抗及遗传易感性密切相关,NAFLD包括了疾病初期阶段的非酒精性单纯性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎,如高危因素持续存在,病情进展后发生肝硬化甚至肝细胞癌等一系列肝脏损害。NAFLD的发生发展过程中,其重要的病理基础是胰岛素抵抗(insulin resistance,IR),因此,我们需要寻找可供研究的胰岛素抵抗或脂质沉积动物模型。在我们课题组的前期基础研究中证实,利用高脂饮食喂养鼠类,经过一段时间的诱导后,可以观察到鼠类动物模型出现肝脏胰岛素抵抗及脂质沉积,因此,本研究选取高脂诱导的胰岛素抵抗模型作为实验模型。氧化苦参碱(Oxymatrine,OMT)又称为苦参素,主要是从苦参、山豆根及苦豆子等中药材中提取而得的一种生物碱。具有利尿、抗感染、降血脂、抗纤维化、抗肿瘤、保护肝细胞及免疫调节等多种作用。在临床上主要用于治疗慢性肝炎、脂肪肝等肝脏损伤。有研究发现,氧化苦参碱可改善高果糖诱导的胰岛素抵抗,减轻肝脏脂质沉积,但具体作用机制尚不清楚,有待深入研究。成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor,FGF)是目前研究比较火热的一类新型生长因子,它们是一个大的家族,目前发现共有22个成员,它们的生理功能也不仅仅局限于初期发现的促进细胞增殖、机体发育及创伤修复等,越来越多的研究发现一些成纤维细胞生长因子在机体的代谢方面发挥了重要作用。其中FGF21就是FGF家族中的一个非典型性成员,FGF21主要在肝脏中表达,在骨骼肌、脂肪组织中虽有表达,但非主要表达器官,相关研究表明,FGF21的主要生物学功能是调节糖脂代谢。临床研究及相关动物实验显示,胰岛素抵抗状态下,血清FGF21水平可增高,调节糖原合成和酮体生成,进而调节胰岛素抵抗。相关研究发现,氧化苦参碱能够通过调节FGF21发挥作用,然而,氧化苦参碱是否通过调节FGF21进而改善高脂诱导大鼠的肝脏脂质沉积及胰岛素抵抗,目前未发现国内外相关报道。目前有关于2型糖尿病合并脂肪肝患者血浆FGF21的表达水平相关研究,观察到伴随机体脂代谢异常及胰岛素抵抗的同时,FGF21血浆表达增加。本研究首先对脂耐量异常人群进行观察,了解甘油三酯水平与FGF21水平相关性,同时观察FGF21与非酒精性脂肪肝的相关性。进一步通过高脂饮食诱导产生大鼠胰岛素抵抗模型,并予以氧化苦参碱干预,观察肝脏组织胰岛素信号通路、脂肪酸代谢通路及FGF21的表达变化。最后通过高脂诱导的肝脏HepG2细胞,在细胞水平求证氧化苦参碱是否通过FGF21改善其胰岛素抵抗及脂质沉积,揭示氧化苦参碱改善非酒精性脂肪肝的作用,为寻找非酒精性脂肪肝新的治疗靶点提供理论依据。第一部分不同脂质代谢人群血清FGF21水平变化与非酒精性脂肪肝发生的相关研究目的:比较不同脂质代谢人群脂肪餐前后FGF21水平变化情况,进一步探讨FGF21与非酒精性脂肪肝的关系。方法:选取2017年6月至2018年1月在河北省人民医院内分泌科参加脂肪餐试验的志愿者93人。受试者知情同意后,行口服脂肪餐试验,抽取空腹及餐后4小时静脉血测定FGF21水平。非酒精性脂肪肝基于超声诊断,诊断标准参照2010年非酒精性脂肪性肝病诊疗指南。按空腹甘油三酯及脂肪餐后4小时甘油三酯水平分为三组,分别为脂耐量正常组(normal fat tolerance,NFT)、脂耐量减低组(impaired fat tolerance,IFT)以及高甘油三酯组(hypertriglyceridemia,HTG)。结果:1.脂耐量正常组、脂耐量减低组、高甘油三酯血症组的BMI比较:与脂耐量正常组比较,脂耐量减低组及高甘油三酯血症组BMI成上升趋势,三组间差异有统计学意义(P<0.05)。2.脂耐量正常组、脂耐量减低组、高甘油三酯血症组的空腹血糖、TC、TG、低密度脂蛋白比较:与脂耐量正常组比较,脂耐量减低组及高甘油三酯血症组空腹血糖、TC、TG、低密度脂蛋白成上升趋势,三组间差异有统计学意义(P<0.05)。3.脂耐量正常组、脂耐量减低组、高甘油三酯血症组非酒精性脂肪肝发生率比较:三组间非酒精性脂肪肝发生率逐渐升高,差异有统计学意义(P<0.05)。根据血清FGF21四分位法将受试者分为四组,从Q1组到Q4组,与Q4组相比,Q1、Q2、Q3组非酒精性脂肪肝的发生率逐渐升高,差异有统计学意义(P<0.05)。4.脂耐量正常组、脂耐量减低组、高甘油三酯血症组空腹FGF21水平与脂肪餐后FGF21水平比较:三组间空腹FGF21水平逐渐升高,脂耐量减低组、高甘油三酯血症组高于脂耐量正常组,高甘油三酯血症组高于脂耐量减低组,差异均有统计学意义(P<0.05),三组间脂肪餐后4h FGF21水平均升高,三组间比较差异有统计学意义(P<0.05),各组空腹FGF21与脂肪餐后4h FGF21水平比较,差异有统计学意义(P<0.05)。小结:1.血清FGF21水平与血清甘油三酯水平密切相关,随着甘油三酯水平的升高,血清FGF21水平逐步升高。2.血清FGF21水平与非酒精性脂肪肝发生密切相关,随着血清FGF21水平升高非酒精性脂肪肝发生增加。第二部分氧化苦参碱对高脂诱导胰岛素抵抗大鼠肝脏脂质沉积的影响目的:探讨氧化苦参碱对高脂诱导大鼠肝脏脂质沉积的变化以及大鼠胰岛素抵抗的影响。方法:8周龄清洁级健康的雄性SD大鼠(180-220g)48只,喂养1周后随机分为2组:正常对照组(normal diet,ND)12只和高脂饮食组(high fat diet,HFD)36只。普通饲料喂养ND组,高脂饲料喂养HFD组。每组小鼠喂养等热量饲料,并详细记录,水自由摄入,定期测定空腹体重。喂养8周后,ND组及HFD组随机抽取大鼠,待测大鼠禁食12小时过夜,次晨空腹行腹腔注射葡萄糖耐量试验(intraperitoneal glucose tolerance test,IPGTT),记录干预后血糖值变化情况,依据公式得出葡萄糖曲线下面积(area under the curve,AUCglu)。待测大鼠同时行清醒状态下高胰岛素-正葡萄糖钳夹试验,比较不同干预后葡萄糖输注率(glucose infusion rate,GIR)变化。证实肝脏胰岛素抵抗模型是否成立。造模成功后,ND组剩余6只大鼠不变,将HFD组剩余的30只大鼠随机分为5组:高脂组(HFD)、氧化苦参碱低剂量组(OMT-L)、氧化苦参碱中剂量组(OMT-M)、氧化苦参碱高剂量组(OMT-H)及二甲双胍组(Met)。OMT-L、OMT-M、OMT-H组分别给予氧化苦参碱50mg/kg、100mg/kg、150mg/kg灌胃,每日一次。Met组予以二甲双胍500mg/kg灌胃,每日一次。ND组及HFD组予以生理盐水2ml/kg灌胃,每日一次。药物干预10周,每周根据体重值调整给药剂量。药物干预10周末,再次行IPGTT及GIR试验,并计算AUCglu。采集血清标本检测基础空腹血糖(fasting blood glucose,FBG)、总胆固醇(total cholesterol,TC)、甘油三酯(triglycerides,TG)、丙氨酸氨基转移酶(alanine amino-transferase,ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(aspartate amino-transferase,AST)。待测血清空腹胰岛素(fasting insulin,FINS)水平及游离脂肪酸(free fat acid,FFA)水平利用酶联免疫吸附法(Enzyme linked immumosorbent assay,ELISA)检测。留取血清标本后,处死各组大鼠,留取肝脏组织,制备透射电镜标本,观察大鼠肝脏超微结构。结果:1.大鼠适应性喂养1周后基础值比较:与正常对照组比较,高脂组大鼠体重及每日平均摄食量之间无明显差异(P>0.05)。2.高脂饮食诱导8周后,肝脏胰岛素抵抗及脂质沉积模型的构建。1)组大鼠基础生化指标比较:与对照组相比,高脂组大鼠体重、FBG、ALT、TC、TG、FINS、FFA均升高(P<0.05),两组大鼠血清AST差异无统计学意义(P>0.05)。2)两组大鼠糖耐量结果的比较:IPGTT结果显示:与对照组比较,高脂饮食组大鼠血糖基础值及干预后15min、30min、60min及120min血糖均升高(P<0.05)。高脂组AUCglu也显著升高(P<0.05)。3)两组大鼠葡萄糖输注率的比较:与正常对照组比较,高脂组大鼠GIR明显降低(P<0.05)。4)两组大鼠肝脏细胞超微结构比较:电镜下可见正常对照组大鼠肝细胞胞浆内无脂滴,线粒体、内质网丰富,内质网排列整齐,高脂组大鼠肝脏细胞中可见脂滴,线粒体模糊不清或缺失,内质网有融合、模糊不清或脱颗粒现象,提示肝脏细胞脂质沉积。3.药物干预10周后,指标变化情况1)各组大鼠基础指标比较:高脂组大鼠体重、FBG、TC、TG、ALT、AST、FINS、FFA均高于正常对照组(P<0.05)。氧化苦参碱各组及二甲双胍组较高脂组降低(P<0.05)。2)各组大鼠糖耐量结果比较:IPGTT结果显示:高脂组大鼠空腹血糖及干预后15min、30min、60min、120min血糖均较对照组升高(P<0.05)。氧化苦参碱各组及二甲双胍组较高脂组降低(P<0.05)。高脂组AUCglu高于正常对照组(P<0.05)。氧化苦参碱各组及二甲双胍组AUCglu较高脂组降低(P<0.05)。3)各组大鼠葡萄糖输注率比较:与对照组比较,高脂组GIR明显降低(P<0.05)。氧化苦参碱各组及二甲双胍组GIR较高脂组升高(P<0.05)。4)各组大鼠肝脏细胞超微结构比较:电镜下可见正常对照组肝细胞胞浆内无脂滴,线粒体、内质网丰富,内质网排列整齐,高脂组肝脏细胞中可见脂滴,线粒体模糊不清或缺失,内质网有融合、模糊不清或脱颗粒现象,均提示肝脏细胞脂质沉积和细胞器损伤。氧化苦参碱干预后高脂+氧化苦参碱各组脂滴较高脂组减少,线粒体肿胀及内质网损失有所减轻。小结:1.高脂饮食能够诱导大鼠出现肝脏脂质沉积及胰岛素抵抗。2.氧化苦参碱能够改善高脂饮食诱导的肝脏脂质沉积,改善葡萄糖耐量及胰岛素抵抗。第三部分氧化苦参碱对高脂诱导大鼠肝脏FGF21表达和胰岛素信号通路及线粒体脂肪酸代谢通路的影响目的:通过检测氧化苦参碱干预后FGF21的mRNA及其蛋白表达,同时观察胰岛素信号通路及脂肪酸代谢通路相关因子表达变化情况,探讨FGF21是否参与氧化苦参碱调节胰岛素信号传导通路及改善线粒体脂肪酸代谢的过程。方法:动物分组及标本采集同第一部分。测定肝脏组织中甘油三酯(Triglyceride,TG)含量。采用RT-PCR检测肝脏组织FGF21、磷脂酰肌醇-3激酶(Phos-phatidylinositol-3 kinase,PI3K)、胰岛素受体底物-1(Insulin receptor substrate 1,IRS-1)、蛋白激酶B(protein kinase B,PKB,又称Akt)、葡萄糖转运蛋白2(glucose transport protein2,GLUT2)的mRNA水平,采用western blot技术检测肝脏组织FGF21蛋白表达水平,胰岛素信号通路p-IRS-1,IRS-1,p-Akt及Akt的表达以及脂肪酸代谢上游因子腺苷酸活化蛋白激酶(Adenosine monophosphate activated protein kinase,AMPK)的磷酸化水平、过氧化物酶体增殖活化受体γ共激活因子-1α(peroxisome proliferator-activa-ted receptorγcoactivator 1α,PGC-1α)、脂肪酸转位酶Transporter fatty acid translocase,FAT/CD36)、肉碱棕榈酰转移酶-1(Carnitine palmitoyl transferase-1,CPT1)的蛋白水平。结果:1.各组大鼠肝脏组织FGF21的mRNA基因水平:与对照组相比,高脂组大鼠FGF21mRNA升高(P<0.05)。氧化苦参碱各组及二甲双胍组较高脂组升高(P<0.05)。2.各组大鼠肝脏组织FGF21蛋白表达:与对照组相比,高脂组大鼠肝脏组织FGF21蛋白水平升高(P<0.05)。氧化苦参碱各组及二甲双胍组较高脂组升高(P<0.05)。3.各组大鼠肝脏组织TG含量的比较。与对照组相比较,高脂组大鼠肝脏TG含量增高(P<0.05)。氧化苦参碱各组及二甲双胍组与高脂组相比,肝脏TG含量降低(P<0.05)。4.与对照组相比,高脂组大鼠肝脏PI3K、IRS-1、Akt、GLUT2的mRNA表达水平降低(P<0.05)。氧化苦参碱各组及二甲双胍组与高脂组相比,肝脏PI3K、IRS-1、Akt、GLUT2的mRNA表达水平升高(P<0.05)。5.与正常对照组相比,高脂组大鼠肝脏组织中p-IRS-1/IRS-1的比值水平增高,p-AKT/AKT的比值水平降低(P<0.05)。氧化苦参碱各组及二甲双胍组与高脂组相比,肝脏组织中p-IRS-1/IRS-1的比值水平降低,p-AKT/AKT的比值水平增高(P<0.05)。6.各组大鼠肝脏AMPK的磷酸化水平、PGC1α、CD36及CPT1的蛋白水平变化比较。与正常对照组相比,高脂组大鼠肝脏组织中p-AMPK水平降低,同时PGC1α及CPT1表达降低,CD36表达升高(P<0.05)。氧化苦参碱各组及二甲双胍组与高脂组相比,肝脏组织中p-AMPK、PGC1α及CPT1的水平回升,CD36表达下降(P<0.05)。小结:1.氧化苦参碱能够提高高脂饮食大鼠肝脏FGF21表达,上调PI3K、IRS-1、Akt、GLUT2表达水平,提示氧化苦参碱能够调控FGF21/IRS-1/Akt/GLUT2通路,从而改善肝脏胰岛素抵抗及糖代谢紊乱。2.氧化苦参碱能够上调p-AMPK及PGC1,提示氧化苦参碱能够调控p-AMPK/PGC1通路,加强脂肪酸的氧化过程,从而改善肝脏脂质沉积。第四部分通过调节FGF21的表达探讨氧化苦参碱改善高脂诱导的肝细胞糖脂代谢紊乱的作用机制目的:通过HepG2细胞的胰岛素抵抗模型。应用转染技术靶向干预FGF21的表达,观察HepG2细胞脂质沉积的变化,探讨氧化苦参碱是否通过FGF21/Akt及FGF21/AMPK通路调节肝细胞中葡萄糖代谢及脂肪酸代谢。方法:在棕榈酸培养的HepG2细胞中分别转染针对FGF21的小干扰RNA及过表达FGF21的质粒,具体分为以下六组:正常对照组(N)、棕榈酸组(Pa)、棕榈酸+氧化苦参碱组低剂量组(Pa+OMT-L)、棕榈酸+氧化苦参碱组高剂量(Pa+OMT-H)、棕榈酸+针对FGF21小干扰RNA组(Pa+S)、棕榈酸+过表达FGF21质粒组(Pa+P)。测定HepG2细胞中TG的水平以观察细胞脂质沉积的情况。采用western blot技术检测FGF21的蛋白表达、胰岛素信号通路p-IRS-1、IRS-1、p-Akt、Akt的蛋白表达、脂肪酸氧化通路p-AMPK、AMPK、CPT1、CD36的蛋白表达情况。结果:1.HepG2细胞的胰岛素抵抗(IR)模型构建:HepG2细胞培养24小时后,高脂组葡萄糖含量较正常对照组增高,提示高脂诱导胰岛素抵抗模型的成功建立。2.靶向干预FGF21对HepG2细胞FGF21表达的影响:在棕榈酸培养的HepG2细胞中分别转染针对FGF21的小干扰RNA及过表达FGF21的质粒后,Pa+S组FGF21的蛋白表达较Pa+OMT组降低,Pa+P组FGF21的蛋白表达较高脂组明显升高(P<0.05)。Pa+S与高脂组比较差异无统计学意义(P>0.05)。Pa+P与Pa+OMT组比较差异无统计学意义(P>0.05)。Pa+OMT不同剂量组FGF21的蛋白表达比较,差异无统计学意义(P>0.05)。3.靶向干预FGF21对HepG2细胞脂质沉积的影响:高脂组TG比正常对照组升高(P<0.05)。Pa+OMT组TG水平较高脂组降低(P<0.05)。Pa+S组TG水平较Pa+OMT组升高(P<0.05)。Pa+P组TG水平较高脂组降低(P<0.05)。Pa+P与Pa+OMT组TG水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。4.靶向干预FGF21对HepG2细胞胰岛素信号通路的影响:高脂组胰岛素信号通路p-IRS-1蛋白表达增高,p-Akt的蛋白表达下降,Pa+OMT组p-IRS-1蛋白表达降低,p-Akt的蛋白表达升高(P<0.05)。Pa+S组与Pa+OMT相比,p-IRS-1的蛋白表达增高、p-Akt的蛋白表达下降(P<0.05),Pa+S与Pa组比较差异无统计学意义(P>0.05)。Pa+P组与高脂组相比,p-IRS-1的蛋白表达下降、p-Akt的蛋白表达增高(P<0.05)。Pa+P与Pa+OMT组比较差异无统计学意义(P>0.05)。5.靶向干预FGF21对HepG2细胞脂肪酸代谢通路的影响:高脂组细胞,脂肪酸代谢通路p-AMPK、CPT1的蛋白表达降低、CD36蛋白表达升高。Pa+OMT组p-AMPK、CPT1的蛋白表达升高、CD36蛋白表达降低(P<0.05)。Pa+S组与Pa+OMT相比,p-AMPK及CPT1α的蛋白表达降低、CD36蛋白表达升高(P<0.05)。Pa+S与高脂组比较差异无统计学意义(P>0.05)。Pa+P组与高脂组相比,p-AMPK及CPT1的蛋白表达增高,CD36蛋白表达降低(P<0.05)。Pa+P与Pa+OMT组比较差异无统计学意义(P>0.05)。小结:1.氧化苦参碱可以通过调控胰岛素信号通路IRS-1及Akt、脂肪酸代谢通路AMPK及CPT1、CD36的表达改善高脂诱导的HepG2细胞的脂质沉积。2.氧化苦参碱能够增加FGF21水平,调控FGF21/IRS-1/Akt及FGF21/AMPK/CPT1通路的表达,FGF21是氧化苦参碱改善高脂诱导胰岛素抵抗及肝脏糖脂代谢紊乱的关键因子。结论:1.高甘油三酯可以使肝脏FGF21分泌入血增加,FGF21的血清水平与非酒精性脂肪肝的发生密切相关。2.FGF21通过增加葡萄糖利用水平,促进肝脏脂肪酸氧化,进而改善胰岛素抵抗及脂质沉积。3.氧化苦参碱通过调节高脂干预前后FGF21的表达水平,对胰岛素信号通路FGF21/Akt/GLUT2及脂肪酸代谢通路FGF21/AMPK/CPT1的表达进行调控,改善高脂诱导的胰岛素抵抗及肝脏糖脂代谢紊乱。