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目的:
赭曲霉毒素A（OchratoxinA，OTA）是由曲霉菌属（主要是赭曲霉）和青霉菌属产生的一种真菌毒素。在世界范围内广泛存在OTA污染，谷物、蔬菜、咖啡、饮料、动物饲料中均有检测到OTA的报道。其毒性作用包括肾毒性、肝毒性、致畸性、免疫毒性、遗传毒性和致癌性等。1993年国际癌症研究中心IARC将OTA归类为“可能的人类致癌物”。本实验室前期研究已经发现，OTA可以诱导正常人胃黏膜上皮细胞DNA双链断裂损伤和G2期阻滞，这可能与胃癌的发生发展密切相关。
哺乳动物核蛋白Rad51，与大肠埃希氏菌重组酶RecA同源，是DNA双链断裂损伤（DNAdoublestrandbreaks，DSBs）精确修复途径—同源重组(HR)的核心蛋白，其分子量为37kDa。Rad51家族成员包括:Rad51B、Rad51C、Rad51D、XRCC2和XRCC3，均参与HR修复过程。Rad51作为一种转移酶通过聚集在DNA断裂末端上形成核蛋白丝，而核蛋白丝可以促进被损伤的DNA链和未受损伤的同源姊妹染色单体进行链交换。其表达异常会直接影响HR的功能，进而影响DSBs的修复，导致基因组的不稳定和肿瘤的发生。
近年来研究发现，紫外照射、电离辐射和丝裂霉素等因素可以刺激多种细胞（包括人乳腺癌细胞、人鼻咽癌细胞和人结肠黏膜上皮细胞等）Rad51焦点形成并聚集，Rad51表达增加，从而修复DSBs。然而在各类细胞毒性因子刺激下Rad51表达和细胞毒性作用（如DNA损伤）之间的关系依然存在争议。在黄曲霉毒素B1作用下啤酒酵母菌Rad51被激活，不对等的姊妹染色单体交换增加，引起基因突变;与此同时，还有研究发现一些化疗药物、缺氧等因素可以使Rad51表达降低，加重细胞毒性作用。而目前有关OTA对人正常细胞Rad51的影响国内外均未见报道。本实验首先探讨HR修复途径中的关键分子Rad51在OTA诱导GES-1细胞DSBs以及G2期阻滞中的作用;接着进一步揭示影响Rad51表达的上游调控机制。这将为评价OTA在胃癌发生、发展中的可能作用提供科学依据。
方法:
1、细胞培养与处理
正常人胃黏膜上皮细胞(GES-1)常规培养在含有10％胎牛血清、100U/ml链霉素、100U/ml青霉素的DMEM培养基中，置于37℃、5％CO2的培养箱中培养，细胞贴壁生长。选择对数生长期的细胞（传代后24h）随机的分为溶剂对照组和实验组。溶剂对照组给予终浓度为0.08％的甲醇（以前的研究显示，当甲醇终浓度为0.08％时，通过MTT和流式细胞术检测分析其对细胞增殖和细胞周期分布均无影响）。实验组分别给予经甲醇稀释后终浓度为5μM、10μM和20μM的OTA，继续培养24h，收集细胞或者给予终浓度为20μM的OTA，而后培养6h、12h和24h后分次收集细胞进行相关指标检测。
2、p38和ERK阻断剂处理
取对数生长期GES-1细胞分别给予p38的阻断剂SB20358010μM或ERK的阻断剂PD9805910μM预处理0.5h，其后加入20μMOTA培养24h，再收集细胞检测Rad51的表达。
3、p53siRNA转染和Rad51质粒转染
用100pmolp53特异性siRNA转染细胞24h后，再加入20μMOTA继续培养24h，然后收集细胞进行相关指标检测。其阴性对照为NegtivecontrolsiRNA(NCsiRNA)。2μg表达Rad51的质粒和作为阴性对照的空质粒也被瞬时转染进GES-1细胞中，在此基础上加入20μMOTA继续培养24h，再收集细胞进行相关指标检测。
4、蛋白免疫印迹(Westernblot)
各种因素处理GES-1细胞后，提取细胞总蛋白，用蛋白免疫印迹方法，检测OTA处理后人胃黏膜上皮细胞GES-1中各种指标的表达情况。
5、实时定量PCR(Quantitativereal-timePCR)
利用实时定量PCR检测不同处理方式对人胃黏膜上皮细胞GES-1中Rad51mRNA表达的影响。每组样品以目的基因与内参照基因人类管家基因β-actin量的比值表示目的基因相对表达量，用比较Ct值的方法进行统计学分析。
6、免疫荧光技术（Immunofluorescencestaining）
GES-1细胞固定后用Rad51一抗和荧光二抗孵育，再用DAPI复染DNA。最后在激光共聚焦显微镜下观察OTA处理细胞后Rad51的表达情况并拍照。
7、流式细胞术检测细胞周期(FCM)
转染和OTA处理后，分别收集各组细胞，再PBS洗涤，离心收集细胞，用70％冰乙醇固定后利用流式细胞术检测细胞周期分布情况。
8、免疫共沉淀(IP)
提取GES-1细胞总蛋白120μg，各组蛋白加入5μgCyclinB1抗体4℃摇床过夜，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测Cdc2-CyclinB1复合物的形成情况。
9、统计学分析
每组实验不少于3次独立样本的重复，采用SPSS软件(13.0)进行相关与回归分析(analysisofCorrelationandRegression)、t检验和单因素方差分析（analysisofvariance，ANOVA），数据用(x)±s表示，检验以P＜0.05为差异有显著性意义。
结果:
1、OTA通过剂量和时间依赖的方式诱导GES-1细胞DNA双链断裂标志物γ-H2AX蛋白表达的增加
Westernblot结果显示，和溶剂对照组相比，5μM、10μM和20μMOTA处理24h后，γ-H2AX蛋白表达水平呈逐渐上升的趋势(r=0.895，P＜0.05)。同时，20μMOTA处理细胞6h、12h和24h后，γ-H2AX蛋白水平随着时间的延长也明显升高(r=0.926，P＜0.05)。
2、OTA通过剂量和时间依赖的方式抑制GES-1细胞Rad51在mRNA及蛋白水平的表达
2.1、Rad51在mRNA水平上的表达:
Real-timePCR结果显示，5μM、10μM和20μMOTA处理GES-1细胞24h后，Rad51在mRNA水平上的表达逐渐降低(r=-0.909，P＜0.05)。20μMOTA（此剂量抑制Rad51表达最明显）分别处理GES-1细胞6h、12h和24h后，随着处理时间延长，Rad51在mRNA水平上的表达也逐渐降低(r=-0.984，P＜0.05)。
2.2、Rad51在蛋白水平上的表达:
与mRNA水平上的表达一致的是，Westernblot结果显示，和溶剂对照组相比，OTA5μM、10μM和20μM处理24h后，Rad51蛋白表达水平呈逐渐降低的趋势(r=-0.952，P＜0.05)。同时，OTA20μM处理细胞6h、12h和24h后，Rad51蛋白水平的表达水平也逐渐降低(r=-0.989，P＜0.05)。
2.3、OTA导致GES-1细胞Rad51焦点的数量减少
免疫荧光结果显示，20μMOTA处理的细胞中Rad51焦点的数量明显少于溶剂对照组(P＜0.05)。
以上结果提示OTA可以下调Rad51的表达，进而抑制HR修复途径。
3、利用质粒瞬时转染Rad51可逆转OTA对GES-1细胞的损伤作用
3.1、Rad51过表达对OTA诱导的GES-1细胞DSBs的影响
Westernblot结果显示，与空质粒+OTA组相比，Rad51质粒+OTA组中γ-H2AX的蛋白表达水平明显降低(P＜0.05)。结果提示Rad51过表达可以抑制OTA诱导的DSBs的发生。
3.2、Rad51过表达对OTA诱导的GES-1细胞G2期阻滞的影响
FCM结果发现，Rad51质粒+OTA组中G2/M期细胞比例与空质粒+OTA组相比明显降低（P＜0.05）。结果提示Rad51过表达可以逆转OTA诱导的GES-1细胞G2阻滞。
Westernblot结果显示，与空质粒+OTA组相比，Rad51质粒+OTA处理组G2/M期关键蛋白（Cdc25C、Cdc2和CyclinB1）的表达水平明显增加(P＜0.05)。同时免疫共沉淀结果显示，Rad51质粒转染后，与空质粒+OTA处理组相比，Rad51质粒+OTA处理组Cdc2-CyclinB1复合物的形成明显增多(P＜0.05)。
4、OTA处理引起GES-1细胞Rad51降低的可能分子机制
我们前期实验发现，OTA处理后的GES-1细胞可激活ERK、p38和p53信号通路，进而调控OTA诱导的G2阻滞。
4.1、ERK和p38信号通路在OTA下调GES-1细胞Rad51表达中的作用
Westernblot结果显示，与OTA处理组相比，ERK特异性阻断剂(PD98059)预处理+OTA处理组Rad51的表达明显升高(P＜0.05)。同时，p38特异性阻断剂(SB203580)预处理也抑制了OTA导致的Rad51表达降低(P＜0.05)。结果提示ERK和p38信号通路可能是OTA下调GES-1细胞Rad51表达的机制之一。
4.2、p53在OTA下调GES-1细胞Rad51表达中的作用
Westernblot检测结果显示，p53siRNA+OTA处理组细胞中Rad51蛋白的表达水平与NCsiRNA+OTA处理组相比明显增加(P＜0.05)。结果表明，p53基因的激活参与调节了OTA引起的GES-1细胞Rad51表达降低。
结论:
1、赭曲霉毒素A处理引起GES-1细胞DNA双链断裂损伤，同时抑制细胞中Rad51的表达。
2、过表达Rad51可以显著逆转赭曲霉毒素A诱导的GES-1细胞DNA双链断裂损伤作用。
3、过表达Rad51可以缓解赭曲霉毒素A诱导的GES-1细胞G2期阻滞。
4、ERK和p38MAPK信号通路以及p53基因的激活参与赭曲霉毒素A抑制Rad51表达的调控。