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目的观察不同浓度的医用臭氧(03)作用于体外培养的应用白介素-1β(IL-1β)干预后的兔膝关节软骨细胞的影响,探讨临床使用03的安全浓度范围。方法在无菌环境下消化得到七月龄新西兰大白兔膝关节软骨细胞,原代培养至第10天纯化软骨细胞,并鉴定体外培养的原代细胞为软骨细胞。然后应用胰蛋白酶进行传代,将传代软骨细胞作为实验用细胞。将传代后的软骨细胞随机分为8组：正常软骨细胞组(N组),模型细胞组即软骨细胞加IL-1β(M组),对照组即N组加不同浓度03(20、40、60μg/mL)(NL、NM、NH组),实验组即M组加不同浓度O3(20、0、60μg/mL)(ML、MM、MH组),共同孵育24h后在倒置相差显微镜下观察细胞形态。应用酶联免疫吸附测定法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)测定干预后软骨细胞培养液中丙二醛(MDA)、肿瘤坏死因子-a (TNF-a)、基质金属蛋白酶-1(MMP-1)和基质金属蛋白酶-3(MMP-3)的含量。结果1.细胞培养及鉴定：原代细胞培养纯化后,采用甲苯胺蓝染色、II型胶原免疫荧光染色的方法,使得培养的原代细胞分别呈现特征性的蓝色和绿色,鉴定其为软骨细胞。2.光镜下细胞形态学改变：20、40μg/mL浓度03干预软骨细胞后,对照组和实验组细胞的形态与正常软骨细胞相似,有少量核固缩；60μg/mL O3干预软骨细胞后,各组细胞均损伤严重,出现空泡样改变,呈凋亡形态。3.生化指标检测：20、40μg/mL浓度03干预软骨细胞24h后,对照组和实验组细胞上清中MDA、TNF-a、MMP-1、MMP-3的含量比模型细胞组降低(P<0.05);60μg/mLO3干预软骨细胞24h后,细胞上清中MDA、TNF-a、MMP-1、 MMP-3的含量比模型细胞组增高(P<0.05)。4.MTT比色法测试细胞增殖速度：不同浓度03干预软骨细胞24h后,均可使其增殖速度较正常软骨细胞降低,但20、40μg/mL浓度O3可使ML、MM组细胞的增殖速度较M组升高(P<0.05),60μg/mL浓度O3作用于正常软骨细胞和OA软骨细胞时,均使其增殖速度减慢(P<0.05)。结论20、40μg/mL医用臭氧通过降低细胞培养液中炎症因子的浓度对骨关节炎软骨细胞有保护作用,60μg/mL医用臭氧对正常软骨细胞和骨关节炎病理过程中的软骨细胞均有损伤作用。