论文部分内容阅读
脂肪肝（fatty liver disease,FLD）是各种病因导致的肝脏中脂类沉积过多,肝脏细胞有明显的脂滴存在。非酒精性脂肪肝（non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD）是正在迅速蔓延的全球性健康问题,在欧美和澳洲等发达国家的发病率为20～40%,在中国NAFLD是仅次于病毒肝炎的第二大肝病。严重的NAFLD可促进肝纤维化、肝癌和2型糖尿病等,因此,预防和治疗NAFLD是肝病研究的重要课题之一。EWSR1（或 EWS）是埃文氏肉瘤相关基因（Ewing sarcoma breakpoint region 1）,但本研究发现EWS在人NAFLD肝组织(切片、高脂喂养（high-fat diet,HFD）的小鼠肝脏、ob/ob和db/db小鼠肝脏以及脂肪酸（fatty acid,FA）刺激的小鼠原代肝细胞中表达显著上升,由此推测EWS与NAFLD密切相关。为验证该推测,本研究构建了小鼠肝脏特异性表达EWS shRNA的腺病毒载体,在高脂喂养、ob/ob和db/db实验小鼠上发现肝脏EWS敲低可使肝脏细胞内脂滴明显减少,脂类合成和储存相关基因表达下调,且高脂诱导或肥胖引起的葡萄糖耐受和胰岛素抵抗得到缓解,高脂诱导或肥胖引起的肝脏损伤得以减轻,肝脏代谢功能恢复正常等。与之相反的是,在正常食物摄取小鼠中过表达EWS,能明显促进肝脏脂滴积累与脂肪肝的形成。因此,EWS能促进NAFLD形成。为探索EWS在NAFLD形成过程中的作用机制,本研究发现在高脂诱导情况下,EWS能进入细胞核与MED1相互作用,二者共同参与多种脂肪合成相关基因的转录与表达。上述结果表明,降低肝细胞内EWS表达水平,有助于逆转NAFLD。为探索EWS表达调控机制,本研究发现EWS是泛素化降解蛋白质,其蛋白质降解依赖E3连接酶Nedd4L介导的泛素-蛋白酶体途径。Nedd4L通过WW domains特异识别且结合含有典型PY motif的EWS,导致EWS被降解。其中EWS蛋白质结构中187和191位PY motif是EWS蛋白被Nedd4L的WW domains识别所必须。因此,Nedd4L通过泛素化降解EWS蛋白,是NAFLD的负调控因子。为确认该作用,本研究构建肝脏特异性表达Nedd4L腺病毒表达载体（Ad-Nedd4L）并感染HFD喂养的小鼠、ob/ob和db/db小鼠。结果表明,Nedd4L过表达可以抑制小鼠肝脏脂滴积累,下调脂类合成与储存相关基因表达,减轻NAFLD小鼠的葡萄糖耐受和胰岛素抵抗,减轻肝损伤水平,最终缓解NAFLD症状。相反地,在正常饲料喂养小鼠中肝脏特异性地敲低Nedd4L,可以增强肝脏中脂滴积累、脂类合成与储存相关基因的表达。Nedd4L抑制肝脏脂肪化在肝原代细胞与细胞株中均得以证实。值得一提的是,在HFD喂养小鼠肝脏与FA处理的肝原代细胞中,均能检测出内源性EWS蛋白质表达水平增高与Nedd4L表达水平降低,且随着脂肪化程度加重,EWS/Nedd4L相互作用与EWS蛋白质泛素化降解相应减弱。上述结果表明,诱导肝细胞内Nedd4L表达能通过级联反应有效逆转脂肪肝,那么Nedd4L是否可能作为小分子药物十预脂肪肝的靶蛋白?为验证该假设,本研究发现文献报道与临床使用的大部分抗脂肪肝药物都能影响肝细胞内Nedd4L表达水平,但作用机制不一。如rapamycin（雷帕霉素）、metformin（二甲双胍）、uosolic acid（熊果酸）、isoglycyrrhizinate（异甘草酸镁）、orlistato（奥利司他）和gmfibrozil（吉布罗菲）能通过稳定Nedd4L 3’-UTR稳定性,增加Nedd4L的mRNA表达;而atorvastatin（阿洛伐他订）、UDCA（熊去氧胆酸）、sibutramine（西布曲明）、vitamin E（维生素E）,包括禁食（fasting）则通过激活Nedd4L启动子转录活性,增加Nedd4L mRNA表达。因此,Nedd4L是上述抗脂肪肝药物共同作用靶作用蛋白。转录水平激活是调控Nedd4L表达的限速步骤,为探索Nedd4L转录表达的调控机制,本研究发现转录因子AP-2α是调控Nedd4L转录激活的关键因子。有趣的是,atorvastatin、UDCA、sibutramine、vitamin E,包括禁食（fasting）都能通过增强AP-2α与Nedd4L promoter结合,转录水平激活Nedd4L mRNA表达;相反地,脂肪酸能明显减弱AP-2α与Nedd4L promoter结合,进而抑制Nedd4L mRNA表达。此外,AP-2α在人NAFLD切片、HFD喂养的小鼠、ob/ob和db/db小鼠的肝脏中均低表达,在肝细胞中过表达AP-2α能明显提升Nedd4L表达水平,进而抑制Nedd4L/EWS/MED1级联反应,逆转脂肪肝。令文总结:原癌基因 EWS具有促脂肪形成的新生物学功能,EWS进核与MED1相互作用,促进脂肪合成与储存相关基因表达。Nedd4L是存在于胞浆中能特异性识别并泛素化降解EWS的E3连接酶,通过诱导EWS降解,Nedd4L能逆转脂肪肝。Nedd4L是多种抗脂肪肝药物的共同作用靶蛋白,转录激活是其表达限速步骤,而AP-2α是启动Nedd4L转录激活的关键转录因子。因此,AP-2α/Nedd4L/EWS/MED1级联反成是本研究发现的调控肝细胞脂肪化的新生物学机制,AP-2α、Nedd4L、EWS和MED1有望成为开发抗脂肪肝小分子药物的新靶蛋白。