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目的:丙型肝炎病毒(HCV)是全球性传染性疾病病原体,慢性感染可能引起肝炎、肝纤维化、肝硬化乃至肝癌。传统治疗方法利巴韦林与干扰素联用毒副作用较大,且持续病毒学应答率(Sustained virological response,SVR)较低,只有50%-60%。目前已经上市的直接抗病毒药物(Direct acting antiviral agents,DAAs)在某些地区持续病毒学应答率高达90%以上。然而DAAs治疗存在以下缺点:药物在疾病晚期不能逆转恶性化进展;DAAs药物价格昂贵,患者常无力负担;DAAs对于某些亚型HCV感染治疗效果较差;药物的使用不能防止新发感染;病毒易出现耐药性变异。接受DAAs治疗的患者,若是目前或曾经感染过HBV,再次感染还会导致严重肝损伤甚至死亡。因此,HCV疫苗的制备对于疾病的防治非常重要。当前研究中HCV疫苗种类有:重组蛋白疫苗、多肽疫苗、DNA疫苗、病毒载体疫苗等。有多个疫苗进入了 Ⅰ/Ⅱ临床试验,DNA疫苗ChronVac-C、腺病毒载体疫苗Ad6-NS、ChAd3-NS等不仅可以在健康人体内诱发有效的体液免疫反应,还可以在慢性感染的患者体内提高干扰素加利巴韦林的持续病毒学应答率。HCV疫苗制备的主要障碍是基因序列的高度异质性,因此在一定的地域,应该根据该地区流行的HCV基因型序列片段。腺病毒载体疫苗以其安全有效、持续时间长、激发免疫反应强等特点成为疫苗研发较好的选择。特异性细胞免疫反应对于HCV的清除起到决定性的作用。因此,我们选取能激发显著细胞免疫的1b型HCVNS3-5Bmut片段,构建候选疫苗AdNSmut,并初步在小鼠上对NS3-5Bmut片段进行免疫原性评价,以期为后续HCV候选疫苗的临床前评价提供可供选择的免疫原和接种方案。方法:PCR从1b型HCV基因中扩增获得NS3-NS5B片段,定点突变NS5B基因使RNA聚合酶失去活性,获得NS3-NS5Bmut片段。将该目的片段连接入腺病毒穿梭质粒pDC315中,Western blot和免疫荧光鉴定该质粒外源基因NS3,NS5B蛋白的表达。重组穿梭质粒pDC315-NS3-5Bmut(缩写为pDC315-NSmut)与腺病毒骨架质粒共转染293A细胞,获得复制缺陷型重组腺病毒AdNSmut,PCR检测外源基因完整性,RT-PCR检测mRNA转录情况,Western blot与质谱检测病毒感染细胞NS3-NS5B蛋白的表达。大量扩增并纯化AdNSmut腺病毒,测定病毒滴度。选择C57BL/6小鼠作为动物模型,分为接种缓冲液的安慰剂组、接种AdEGFP的阴性对照组、接种AdNSmut的实验组。不同病毒注射组分别肌肉注射 108PFU、109PFU、1010PFU、1011PFU 的 AdEGFP 或 AdNSmut,经过初次免疫3周,加强免疫2周后分离小鼠脾脏淋巴细胞,Elispot和流式胞内染色检测细胞免疫反应,眼球取血检测体液免疫反应。结果:PCR扩增获得HCV 1b NS3-5Bmut序列,成功构建pDC315-NSmut穿梭质粒,免疫荧光和Western blot证实该质粒能表达正确的NS3 NS5B外源蛋白。重组穿梭质粒和骨架质粒共转染293A细胞,包装产生了具有感染性且表达外源基因的复制缺陷型重组腺病毒AdNSmut。纯化后获得滴度为2.74×1013PFU/ml的高纯度高滴度病毒,用于免疫接种C57BL/6小鼠,免疫后检测到接种AdNSmut的小鼠有显著的HCV特异性细胞免疫反应。结论:本研究成功构建了能够表达1b型HCV非结构蛋白NS3-5Bmut的复制缺陷型重组腺病毒AdNSmut。该重组腺病毒能够实现快速、大量、高纯度制备,能够在C57BL/6小鼠体内诱发显著地细胞免疫反应,安全有效,证明NS3-5Bmut片段有望作为HCV候选疫苗的免疫原,同时也为HCV腺病毒疫苗动物实验病毒接种滴度和免疫方案提供了参考。