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目的： 利用GP73特异性多克隆抗体和GP73核酸适配子,建立基于抗体-适配子双夹心的GP73ELISA检测方法,并进行方法学鉴定和初步的临床应用价值探讨。 方法： 1.利用本课题组制备的人GP73重组蛋白、特异性GP73多克隆抗体和GP73适配子,以抗体-适配子双夹心的模式,探索ELISA检测条件,包括GP73特异性抗体包被浓度、生物素标志的GP73适配子工作浓度、辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素的工作浓度以及封闭液浓度、反应的温度和时间等最佳工作条件。 2.根据最佳工作条件,用GP73重组蛋白稀释成系列浓度进行ELISA检测,并以蛋白浓度为横坐标,以OD450nm值为纵坐标,绘制标准曲线并建立回归方程。计算空白对照OD450nm值的均数(mean)和标准差(SD),计算系统的最低检测限,即灵敏度。 3.根据标准曲线批内及批间变异、线性评价、回收实验等试验衡量所建立方法的精确度、线性及准确度。 4.用方阵滴定法确定血清标本的稀释倍数及其他最佳检测条件,测定59例对照组、77例肝癌、21例肝硬化,20例肝炎患者血清GP73的含量,并对59例对照组患者以及77例肝癌患者血清同步进行电化学发光定量测定AFP水平。 5.对比各组数据,对所建立方法的临床应用价值作出初步判断。 结果： 1.经正交试验和方阵滴定实验,确定GP73抗体-适配子双夹心ELISA检测系统的最佳工作条件为:GP73特异性抗体包被浓度为5μg/ml(稀释度为1:1000)、生物素标记的GP73特异性适配子工作浓度为15ng/ml(稀释度为1:2000)、辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素稀释度为1:2000,封闭液为PH7.4含2％BSA的PBST,4℃封闭过夜。最佳反应时间和温度分别为37℃和1小时。 2.用建立的方法检测系列浓度的重组GP73,绘制的标准曲线表明其在12.0～400ng/ml的区间具有良好线性关系。回归方程为y=0.0028x+0.0906(R2=0.9694)。灵敏度为12.0ng/ml。 3.标准曲线的批内变异系数为3.87%,批间变异系数平均为4.44%,用高浓度样本作倍比稀释后测定值与预期值符合率为93.75-101.5%,该检测方法有良好的线性;平均回收率为95.8%,有较高的检测准确度。 4.对59例对照组患者、77例肝癌患者、20例肝炎、21例肝硬化患者进行血清GP73检测的结果显示,肝癌患者血清中GP73的含量(178.2±89.6ng/ml)明显高于对照组患者(18.7±6.7ng/ml,P<0.05),与肝炎、肝硬化患者血清水平相比也明显升高(P<0.05)。通过对对照组患者和肝癌患者血清AFP同步化学发光定量检测的结果对比显示,在肝癌早期(包括T1和T2),患者血清中的GP73水平(124.3±38.9ng/ml)比对照组明显增高(P<0.05),而早期肝癌患者血清AFP含量(13.8±9.3ng/ml)与对照组(4.3±0.9ng/m)相比差异不显著(P>0.05)。 结论： 1.建立了基于抗体-适配子夹心的GP73ELISA检测方法,并确定了该方法的最佳测定条件。 2.该方法具有较宽的线性检测范围(12.0～400ng/ml)及较高的检测灵敏度(12.0ng/ml),有较好的重复性、线性及准确性。 3.该方法初步应用于血清样本GP73水平的检测,检测结果显示肝癌患者血清中GP73含量明显高于对照组、肝炎组及肝硬化组患者。 4.对于早期肝癌患者,GP73水平的变化都表现出比AFP更明显的特异度及敏感度。