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脑缺血后中枢神经系统炎性细胞的浸润及促炎细胞因子的过度表达,均可对脑组织造成不可逆的损害,严重影响缺血后神经功能恢复。脑缺血后炎症级联反应持续时间较长、发生在缺血的较晚期,可造成脑缺血后继发损伤,加重脑缺血后脑损伤程度,因此炎症反应作为脑缺血后导致神经功能缺损病理生理机制的一个重要环节。抑制缺血后炎症反应,促进缺血后神经功能恢复成为目前研究的新靶点。 CD4+CD25+Foxp3+调节性T(Regulatory,Treg)细胞是一类具有独特免疫调节功能的T细胞亚群,能够抑制自身反应性T细胞的表达、阻止自身免疫性疾病的发生、维持自身免疫耐受等,是炎性损伤的主要免疫调节细胞。目前认为该群细胞最具特异的标志是叉头翼螺旋转录因子Foxp3,其在诱导Treg细胞的产生和维持作用方面具有重要作用,此外Treg细胞还可以通过分泌转化生长因子(transforming growth factor,TGF)-β、白细胞介素(interleukin,IL)-10等细胞因子,发挥其免疫调节功能。研究表明急性缺血性脑卒中后存在Treg细胞数量和功能的改变,以往的研究发现在脑出血后同样存在Treg细胞数量和功能的改变,这些结果提供了Treg细胞可能参与脑损伤发展的证据。目前的研究集中在外源性移植Treg细胞或外源性应用Treg细胞源性细胞因子对急性脑缺性脑卒中的神经保护研究。体内是否存在某信号通路可以增强Treg细胞的活性以及活化后的Treg细胞是否可以更好的发挥其神经保护作用仍不清楚。 IL-33是IL-1细胞因子家族成员,通过结合其特异性受体ST2参与缺血性脑卒中后的炎症过程。在小鼠大脑中动脉闭塞(Middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型中,外源性上调IL-33/ST2轴可通过调节卒中后CD4+T细胞亚群Th2的功能进而降低卒中后小鼠神经功能损伤程度。研究显示Treg细胞表面可表达ST2受体,IL-33/ST2轴可以通过多途径调节Treg细胞数量与功能。Matta等研究发现IL-33/ST2轴体内外均可直接或间接促进Treg细胞增殖。因此,探索可以活化Treg细胞的信号通路,进而上调内源性Treg细胞功能有望发现新的脑卒中后神经保护的治疗策略。 目的: 明确IL-33/ST2轴和Treg细胞在急性缺血性脑卒中中的关系,进一步揭示IL-33/ST2轴活化Treg细胞对急性缺血性脑卒中的作用及机制。 方法: 1.在细胞水平构建神经元的氧糖剥夺(oxygen and glucose deprivation,OGD)模型,用普通Treg细胞培养基、IL-33条件培养基(conditioned medium,CM)、IL-33+sST2CM、sST2CM培养Treg细胞24小时,应用Elisa法分析Treg细胞相关细胞因子(IL-10、IL-35、TGF-β)表达水平。将培养基上清液分别作用于OGD过程中的神经元,应用MTT法、Western Blot分析神经元存活率和凋亡相关蛋白(Caspase-3and Bcl-2)表达水平。 2.在动物水平研究中,构建短暂性大脑中动脉闭塞(transient middle cerebral occlusion,tMCAO)模型,采用规律腹腔注射抗CD25抗体构建低Treg细胞tMCAO小鼠,规律腹腔注射抗ST2抗体构建ST2阻断tMCAO小鼠,记录分析小鼠体重、生存率,应用mNSS评分、平衡木实验、转轮实验分析小鼠行为学,应用TTC染色分析梗死体积大小,应用干湿重法分析脑水肿程度,应用Western Blot、TUNEL染色分析细胞凋亡程度,应用流式细胞术和Western Blot分析Treg细胞数量及相关细胞因子表达水平。 结果: 1.经流式细胞术检测,anti-CD25组脑组织中CD3+CD4+Foxp3+Treg细胞百分比与空白手术组相比明显降低(P<0.001)。anti-CD25组小鼠的mNSS评分在14天内持续升高,转轮实验掉落潜伏期明显缩短。TTC染色显示anti-CD25组梗死体积较空白手术组大(P=0.016),TUNEL染色结果显示anti-CD25组细胞死亡程度更高,干湿重法显示anti-CD25组小鼠的脑含水量比空白手术组明显增加(P=0.023)。 2.MTT结果显示,与其它OGD组相比,IL-33条件Treg细胞培养基显著升高OGD后神经元的存活率(P=0.004),其它三组间神经元存活率无统计学差异(P=0.997)。在tMCAO模型中,外源性给与IL-33后经流式细胞术检测显示:anti-CD25+IL-33组Treg细胞百分比较anti-CD25明显升高(P<0.001),同时给与抗ST2抗体的IL-33+anti-ST2组脑组织中Treg细胞百分比为4.48±0.78%,与IL-33组相比明显降低(P<0.001)。 3.TTC染色显示外源性给与IL-33后梗死体积为25.9±2.21%,较anti-CD25组明显减小(P=0.002),TUNEL染色结果以此一致。anti-CD25+IL-33组小鼠的水肿程度比anti-CD25组减轻(P=0.002)。anti-CD25+IL-33组的mNSS评分明显低于anti-CD25组(P=0.005),转轮实验和平衡木实验结果与此一致。。 4.Western blot检测凋亡相关蛋白(Caspase3、Bcl-2和Bax)表达水平,结果显示,OGD模型中,IL-33显著下调凋亡相关蛋白Caspase-3的蛋白水平(P=0.072)、上调Bcl-2蛋白水平,其它三组间凋亡相关蛋白表达水平无统计学差异(P=0.997)。在tMCAO模型中,anti-CD25组与空白手术组相比,Caspase-3和Bax水平明显上调(P<0.001;P=0.020),Bcl-2蛋白表达明显下调(P=0.002)。而anti-CD25+IL-33组与anti-CD25组相比,Caspase-3和Bax表达水平下调(P=0.003;P<0.001),Bcl-2蛋白表达上调(P=0.013)。 5.Elisa检测Treg相关细胞因子(IL-10、IL-35、TGF-β)在培养基上清液中的浓度,与其它三组相比,IL-33组Treg细胞相关细胞因子IL-10(P<0.001)、IL-35(P=0.004)和TGF-β(P<0.001)的浓度显著增高,其它三组间细胞因子浓度无统计学差异。在小鼠缺血脑组织中,三种细胞因子在各组中变化情况一致。以IL-10水平为例,anti-CD25组IL-10水平较空白手术组明显降低(P=0.004),anti-CD25+IL-33组较anti-CD25组IL-10水平明显升高(P=0.036),IL-33明显升高缺血再灌注损伤后IL-10水平(P=0.015),注射抗ST2抗体后IL-10水平明显下降(P=0.025)。 结论: 1.进一步明确Treg细胞在缺血性脑卒中中具有神经保护作用; 2.IL-33通过ST2途径诱导Treg细胞向缺血脑组织募集; 3.IL-33/ST2轴活化Treg细胞以抗凋亡蛋白和细胞因子依赖的方式保护缺血性脑卒中。