松花粉多糖及酯化多糖具有良好的免疫活性,对炎症因子的调节具有重要作用。本实验室前期研究证实,松花粉多糖及其酯化物在免疫水平上对小鼠溃疡性结肠炎有治疗作用,推测松花粉多糖及酯化多糖对免疫因子的调节是否与保护肠上皮细胞屏障有关,此外大量研究发现程序性坏死与炎症又有着密不可分的联系。本实验运用了前期实验室提取分离纯化及酯化多糖的方法,在已摸索好结肠炎小鼠的建模方法基础上,重点探究了松花粉多糖及酯化多糖调节结肠炎小鼠肠道屏障的作用以及是否能够通过调节RIPK3介导的程序性坏死通路在体内发挥抗炎作用。本实验主要包括以下几个部分:一.松花粉多糖的提取分离纯化及硫酸酯化。松花粉多糖的提取工作依照本实验室前期的提取方法,即选用水煮醇沉法进行提取,三氯乙酸去蛋白,根据得率及纯度,最终选用60%乙醇提取出来的多糖,称为PPM60。PPM60通过Sephacryl TMS-400凝胶层析过滤方法进行分离纯化,分为五个组分,根据得率选择第3组分继续进行后续实验,即PPM60-Ⅲ。氯磺酸-吡啶法进行硫酸酯化处理,得硫酸化多糖即SPPM60-Ⅲ。二.根据实验室之前的研究成果,用3%DSS水溶液7天建立小鼠溃疡性结肠炎症模型。实验小鼠分4个组,即正常组（HC）、模型组（DSS）、多糖组（PPM）、酯化多糖组（SPPM）。每天称量体重并观察记录粪便情况。实验结束后麻醉取血,绘制小鼠体重变化图,DAI评分图,以及结肠长度图,HE染色观察结肠病理组织切片。DSS组的小鼠体重下降明显、DAI评分明显升高、结肠长度明显缩短、结肠损伤严重,PPM及SPPM组都缓解了其变化趋势,并不同程度修复了结肠损伤。三.Elisa试剂盒检测小鼠血清中的炎症因子含量变化,包括IL-10、IL-18、IL-6、TNF-α、IL-1β。Western blotting实验检测结肠组织中COX-2和i NOS的含量变化。结果显示,DSS组中抑炎因子IL-10的含量降低,促炎因子IL-18、IL-6、TNF-α、IL-1β的含量升高,而PPM和SPPM组显著改善这种情况;DSS组中,炎症相关酶的含量升高,PPM组和SPPM组显著降低了炎症相关酶的含量。四.研究小鼠体内RIPK3通路相关蛋白的表达变化。通过Western blotting分析RIPK3通路介导的程序性坏死标志蛋白即RIPK3、MLKL、RIPK1、Caspase-8的含量变化,并进一步分析在该通路中发生磷酸化的标志蛋白的含量表达,即p-RIPK3、p-RIPK1、p-MLKL的含量表达,验证是否在此过程中发生程序性坏死通路的调节作用。实验发现,DSS诱导的结肠炎小鼠体内RIPK3、MLKL、RIPK1的蛋白表达升高,而PPM和SPPM组中的表达降低,表明RIPK3、MLKL、RIPK1在治疗炎症中发挥作用,调节了RIPK3通路。此外,DSS诱导的结肠炎小鼠中p-RIPK3、p-RIPK1、p-MLKL的表达明显升高,而PPM和SPPM组中的表达降低,Caspase-8的表达变化则恰好相反,表明在此过程中可能调节了RIPK3介导的程序性坏死通路从而治疗小鼠结肠炎。另外,RT-q PCR结果也表现出相同趋势,但不具显著性差异。五.研究小鼠结肠组织中肠上皮细胞紧密连接的变化。通过透射电子显微镜观察肠上皮细胞的紧密连接,免疫荧光分析紧密连接相关蛋白ZO-1和Occludin的分布表达,Western blotting分析ZO-1、Occludin、Claudin-1的蛋白表达含量。结果表明,DSS诱导的结肠炎小鼠肠上皮细胞的紧密连接遭到严重破坏,紧密连接相关蛋白的表达降低,而PPM和SPPM组细胞紧密连接情况得到改善,相关蛋白表达含量升高。六.本实验利用了16S r DNA扩增子测序,对小鼠结肠组织内容物微生物种群的多样性进行了一系列研究,结果发现厚壁菌门、拟杆菌门、变形菌门是肠道菌群的优势菌种,其中厚壁菌门、拟杆菌门在DSS模型组中丰度降低,变形菌门在DSS模型组中丰度升高,PPM及SPPM组改善其变化。变形菌、芽孢杆菌、埃希氏菌等有害菌种在DSS组中丰度较高,拟杆菌、拟普雷沃菌、阿克曼氏菌、Faecalibacterium等有益菌的丰度降低,PPM及SPPM组中调节了菌种的丰度,改善菌群变化,维持了肠道菌群的平衡,菌群的调节又进一步恢复了上皮细胞的屏障保护作用。本实验结果表明,PPM60-III和SPPM60-III对溃疡性结肠炎小鼠有一定的治疗作用,其作用机制可能是通过调节RIPK3通路、调节肠道菌群及上皮细胞的紧密连接修复了肠道屏障达到治疗炎症的效果。