生长素和水杨酸是调节植物生长发育和抗病防卫能力的植物激素。当植物受到病原菌侵染时,植物通过调节激素信号的交叉对话,从而协调生长和抗病性。但如何调控该交叉对话还不清楚。因此,本博士论文着重解析WD40结构域的蛋白质NtTTG2,具有作为烟草生长素和水杨酸酸交叉对话的调节的作用。将有助于进一步理解植物防卫反应的机制,同时,为阐明植物生长发育信号通路与植物防卫通路的交叉对话提供研究基础。1.烟草NtTTG2基因全长cDNA的克隆与序列分析使用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)结合cDNA末端快速克隆(RACE)技术,从烟草(Nicotiana tabacum) NC89品种中克隆了烟草表皮毛相关基因NtTTG2(Nicotiana tabacum Transparent Testa Glabra2), GENBANK登录号：FJ795022,并对该基因进行了生物信息学分析。NtTTG2全长共1379bp,开放阅读框为1029bp,预测其编码的蛋白质序列存在4个WD40重复(WD40-repeat)的结构域,表明NtTTG2有与其它蛋白质结合的能力。蛋白序列同源性比对结果显示,NtTTG2与其他的表皮毛相关蛋白以及矮牵牛中调控花瓣色素合成的蛋白AN11有较高的同源性,由此推测NtTTG2与烟草表皮毛的生物学功能或花色素的合成有关,实验表明,NtTTG2在烟草根、茎、叶、花中都有表达,且在花中表达量最高。NAA(生长素合成剂)处理烟草后,NtTTG2上调表达,但SA处理后表达下调。病原菌接种后,NtTTG2表达受到抑制。NtTTG2定位于细胞质和细胞核。2. NtTTG2激活生长素信号通路但抑制水杨酸信号通路为了进一步研究NtTTG2在烟草中的作用,我们对烟草NtTTG2基因进行了沉默和过表达操作。我们选用了NtTTG23’UTR部分,分别正反向连在载体pBSSK中的内含子两端,成功构建了NtTTG2的发夹沉默载体,同时NtTTG2与35S启动子相连构建了NtTTG2过表达载体,分别通过叶盘法分别将两个载体转入烟草NC89中,产生了沉默植株(TTG2iNC)和过表达植株(TOTNC)。然后检测转基因植物中TTG2基因的表达情况,发现与对照(TCNC)相比,TTG2iNC4植株沉默效果较好,TOTNC1基因过表达效果最好。这为以后的表型分析,生理生化鉴定以及深入研究该基因在烟草信号传导过程中的作用提供了材料与依据。生长素信号传导标志基因ARF8的表达在TCNC、TTG2iNC4和TOTNC1中三个品系中表达有大的变化,与对照TCNC相比,ARF8在TTG2iNC4的各个器官中几乎没有表达,相反,ARF8在TOTNC1中的表达高于同期的TCNC。对生长素信号传导标志基因ARF8.GH3和水杨酸信号通路PR-1a、 PR-2a的表达情况进行了检测。Real Time PCR结果表明,ARF8、GH3在TTG2iNC中的表达显著低于TCNC中的表达,但两者在TOTNC中表达量远远高于TCNC,尤其是在TOTNC1品系中。PR-1a、PR-2a在TTG2iNC中表达量远远高于TCNC。我们推测NtTTG2激活生长素信号通路并且抑制水杨酸信号通路。3. NtTTG2通过影响生长素信号通路促进烟草生长发育生长素调节植物生长发育的几乎每一个方面,NtTTG2可能通过生长素信号在烟草的生长发育发挥了一定的作用。为了验证这一假说,我们首先观察测量了不同基因型烟草(TTG2iNC4、TOTNC1和TCNC)在MS培养基上的根长及盆栽植株的地上生长情况,并测定了NtTTG2表达以及EXP1和EXP2的表达水平,同时对其株高和鲜重进行统计。实验结果表明NtTTG2沉默后烟草的EXP1和EXP2表达降低,烟草生长缓慢。NtTTG2通过调控DFR和ANS的表达从而影响花瓣着色,花青素含量降低。NtTTG2沉默后导致烟草败育种子数量减少。NtTTG2过表达后促进烟草生长及花瓣着色并且种子数量增加。综上所述,我们通过基因沉默和过量表达的方法,研究了NtTTG2在植物体内的功能,发现它可以促进烟草生长,花色素苷的生成,而且可以使烟草的种子数量增加。同时IAA在TCNC, TTG2iNC4和TOTNC4相同器官里含量相近,说明NtTTG2不影响植物生长素的生成,它通过影响生长素信号的传导从而影响烟草的生长。4. MTTG2抑制SA/NPR1信号通路介导的防卫反应为验证NtTTG2在烟草抗病反应中是否有重要作用,我们对不同基因型烟草(TTG2iNC4、TOTNC1和TCNC)的叶片分别接种黄瓜花叶病毒(CMV)、烟草花叶病毒(TMV)和大白菜软腐病菌(Pcc),并用缓冲液作为对照,随后对发病表型进行观察和发病程度的定量及PR基因的表达的检测。结果表明,与TCNC相比,TTG2iNC4比较抗病,而TOTNC1较为感病。表明NtTTG2对烟草的抗病性具有负调控作用。以三生烟为背景产生了NtTTG2过表达的植株TOTX,及其对照植株TC-Xanthi,并且用病毒介导基因沉默方法得到了以三生烟为背景的TTG2沉默植株的TTG2iX.这些以三生烟为背景的不同基因型接种病原菌后的表型分析更加确定了NtTTG2抑制植物抗病性的作用。烟草NahG(以三生烟为背景)因为不积累水杨酸所以高度感病。我们以的NahG为背景采用病毒介导的基因沉默方法产生了NtTTG2沉默的烟草TTG2i NahG,对三生、NahG和TTG2i NahG烟草接种CMV、TMV和Pcc,正如预期,TTG2i NahG与Xanthi发病程度相似,都比NahG表现出一定的抗病性。接种病原物后,根据病菌生长和发病症状,进一步测试了NPR1和TTG2相互作用对抗病性的影响。我们以TC-Xanthi和TTG2iX为背景使用VIGS产生了NPR1沉默烟草NPR1i和TTG2i NPR1i。TTG2i NPR1i1比NPR1i1抗病但比TTG2iX1较感病。因止匕,NtTTG2和NPR1基因相互拮抗调节抗病性。综上所述,TTG2抑制SA/NPR1信号通路介导的防卫反应从而负调控植物的抗病性。5. NtTTG2通过影响ARF8和NPR1的核定位而调节生长素信号和水杨酸信号通路的下游基因TTG2是一个典型的WD40结构域蛋白,酵母双杂交及双分子荧光互补实验结果表明TTG2与ARF8或NPR1在酵母和植物中都不能发生互作。以带有RFP标签的TCNC、融合RFP的TTG2过表达的TOTNC1,及TTG2沉默的TTG2iNC4为材料,瞬时表达融合黄色荧光蛋白YFP的ARF8和融合绿色荧光蛋白GFP的NPR1；用激光共聚焦显微镜观察荧光蛋白在植物根部的瞬时表达情况。观察结果表明TTG2影响ARF8和NPR1在TCNC, TTG2iNC4和TOTNC1的细胞定位。ARF8在TOTNC1中主要定位于细胞核,但在TTG2iNC4只有较弱的荧光,NPR1在TTG2沉默的TTG2iNC4中表现出比对照TCNC更多的定位于细胞核,同时NPR1蛋白质在TOTNC1中定位于细胞质,说明NtTTG2促进ARF8定位细胞核而将NPR1扣留在细胞质中。通过将NPR1和ARF8在TCNC, TTG2iNC4和TOTNC1瞬时表达后,ARF8基因在TOTNC1增加,在TTG2iNC4减少,但NPR1基因变化不大,说明TTG2的沉默或过表达影响了ARF8基因的表达,以及ARF8和NPR1的蛋白表达量；同时检测了PR-1α、PR-2α与GH3的表达情况,发现PR-1α和PR-2α在TTG2iNC4中表达上调,在TOTNC1不影响两者的表达,变化不明显。与此相反TOTNC1中GH3诱导表达,但在TTG2iNC4中表达受到抑制。