创伤性视神经损伤(traumatic optic neuropathy,TON)是颅脑损伤的合并症,其发生常与创伤性脑损伤(traumatic brain injury,TBI)相关。创伤性视神经损伤的发病率在1.5%-4%之间,其主要特征包括:视网膜细胞的死亡、视神经变性和视力下降。创伤性视神经损伤的伤员往往会经历视力的下降乃至失明等症状,严重的影响伤员重返工作岗位,为家庭和社会带来极大的经济负担。因此,寻求一种有效的治疗方式保留并恢复创伤性视神经损伤伤员的视力,是一个亟待解决的问题。创伤性视神经损伤的产生因素主要有两种:直接损伤和间接损伤。直接损伤指视神经的贯穿性损伤,间接损伤则指外力的间接作用于视神经或脑损伤后的继发作用(如轴突剪切、水肿、炎症或颅内压升高)对视神经造成的损伤。其病理生理过程具有多种因素,主要包含了原发性损伤和继发性损伤两个部分。视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells,RGCs)的轴突汇集成视神经,在外伤后,视神经的一部分立即被切断,会导致部分RGCs死亡。此外,由于直接的机械压迫和血管缺血,在视神经管的狭窄范围内有一定程度的视神经肿胀,这将进一步损害RGCs,产生一种损伤的恶性循环。视神经作为高度分化的中枢神经,在损伤后,存活的RGCs难以自发地再生轴突,这导致视神经的永久性切断及视觉功能的丧失。因此,在TON中降低RGCs的凋亡,促进RGCs的再生有望成为一种有效的治疗靶点。信使RNA(messenger RNA,m RNA)有多种多样的修饰,包括N1甲基腺苷(m1A)、5-甲基胞嘧啶(m5C)和N6甲基腺苷(m6A)等修饰,其中m6A修饰最为广泛。m RNA的m6A修饰在20世纪70年代初即被发现,但是由于当时技术水平的限制,未发现m6A修饰的生理功能相关性。近年来,随着甲基化RNA免疫沉淀测序(Me RIP)等技术的发展,m6A修饰重新成为研究热点领域。最新的研究发现,m6A在真核细胞中的修饰非常广泛,在转录体中存在的比例超过25%,并且其在功能上可以调节真核转录组以影响m RNA的剪接、导出、定位、翻译和稳定性。考虑到m6A修饰在调节蛋白质翻译和参与各种生物过程中不可或缺的功能,有理由推测m6A修饰的调控也可能与创伤性视神经损伤有关,TON后RGCs的凋亡过程中,m6A修饰可能会发生改变,并对凋亡的相关信号通路发挥作用。目前,创伤视神经损伤的病人在入院时,往往先接受颅脑创伤的治疗。待颅脑创伤情况稳定后再行内镜视神经减压手术,但是有研究发现在视神经损伤后,大量RGCs会在损伤的2周内坏死和凋亡。损伤与手术的间隔时间如能小于3天,将有助于伤员远期的视力改善,如果间隔大于3天,则视力改善的可能性较小。随着时间的推移,RGCs将会不断坏死凋亡,阻碍视觉冲动的神经信号传导,手术减压即使能消除压迫因素,也难以逆转RGCs的凋亡。如能在创伤性视神经损伤早期即采取干预措施,采用手术或药物治疗手段减少RGCs的坏死凋亡,将在保存创伤性视神经损伤伤员视力方面具有极大的价值。鉴于此,为了探索创伤性视神经损伤早期治疗的新思路,有必要研究m RNA的m6A修饰在其病理生理过程中发挥的作用。为探究m6A修饰在视神经损伤早期轴突的保留和恢复中的特性,本课题组通过模型建立、免疫荧光、Me RIP-seq、通路分析等手段,完成创伤性视神经损伤早期视网膜组织m6A修饰差异性表达及功能分析的研究:1.创伤性视神经损伤模型的建立与评价;2.创伤性视神经损伤早期视网膜组织中m RNA的m6A修饰差异性表达及功能分析。第一部分:创伤性视神经损伤模型的建立及评价研究目的:(1)建立可重复的创伤性视神经损伤大鼠模型,并评价模型对于视神经、视网膜的损伤效果;(2)探究视神经损伤早期视网膜组织中m6A修饰相关基因的表达有无改变。研究方法:取健康的成年雄性SD大鼠60只,随机分为模型组和对照组,暴露模型组大鼠左眼视神经,用特制镊于球后2 mm夹伤视神经。对照组手术操作暴露左眼视神经但不予致伤。在致伤12 h、3 d、7 d和14 d,分别从模型组和对照组各取6只大鼠的左眼进行HE染色、Brn3a免疫荧光染色。对两组视网膜的RGCs细胞进行计数,比较差异。在致伤后12 h,取剩余12只大鼠的视网膜组织,提取RNA后进行RT-q PCR分析,比较创伤性视神经损伤早期模型组和对照组视网膜中m6A相关基因FTO、ALKBH5、METTL3、METTL4和WTAP的表达差异。研究结果:(1)HE染色:视神经损伤后,在12 h、3 d、7 d和14 d时间点,模型组RGCs计数(18.21±0.19、16.58±0.32、14.29±0.92、10.94±0.49),对照组计数(19.46±0.43、19.04±0.39、19.73±0.21、19.63±0.35)。HE染色示RGCs数量明显减少,与对照组相比,模型组RGCs计数在12 h、3 d、7 d和14 d分别下降6.4%、12.9%、28.1%和44.2%(P<0.05);(2)免疫荧光染色:在12 h、3 d、7 d和14 d,模型组RGCs计数(18.23±0.48、16.08±0.27、13.88±0.53、10.48±0.39),对照组(19.71±0.21、19.77±0.72、19.13±0.61、18.27±0.44),分别下降7.5%、18.6%、27.4%和42.1%(P<0.05);(3)通过RT-q PCR分析,发现模型组大鼠视网膜组组织中,m RNA甲基化相关基因ALKBH5、FTO、METTL3、METTL4和WTAP的表达均上调。研究结论:(1)大鼠创伤性视神经损伤模型稳定性良好,可操作性强、操作简单,该模型可有效地模拟临床中创伤性视神经损伤后视网膜的病理生理变化;(2)创伤性视神经损伤早期,视网膜组织发生了m6A修饰相关基因的表达上调,这表明在视神经损伤发生后,视网膜组织中m RNA的甲基化可能发生改变。第二部分:创伤性视神经损伤早期视网膜组织中m RNA的m6A修饰差异性表达及功能分析研究目的:探究创伤性视神经损伤早期大鼠视网膜中m RNA甲基化修饰的差异性表达,并通过基因本体分析、通路分析预测其功能,期望为创伤性视神经损伤的诊断、早期治疗与预后提供新的信息。研究方法:在创伤性视神经损伤大鼠模型的基础上,取24只大鼠,随机分为模型组和对照组。模型组对左眼进行视神经损伤处理,对照组手术暴露视神经但不进行致伤处理。在造模后第12h处死大鼠,取大鼠的视网膜组织。将4份大鼠的视网膜组织合并为一个样本,共6组样本(3组模型样本和3组对照样本)。提取视网膜组织的RNA后,取一部分RNA进行m6A RNA免疫沉淀反应。对未进行免疫沉淀反应的样品,以及免疫沉淀后的IP RNA样品进行RNA测序文库构建。经过测序仪测序、图像分析、碱基识别和质控后,产生原始数据。使用Q30进行质控,获得高质量结果。随后进行差异甲基化基因识别。使用自有程序筛选位于m RNA的exon上的峰,进行相应的注释。采用3对样本进行重复测序,比对3次,筛选出可信的m6A修饰改变。对创伤性视神经损伤特异的差异甲基化的编码基因进行GO和KEGG通路分析。研究结果:(1)基因的差异性表达:通过分析,在视神经损伤早期,共检测出520个上调的m RNA以及258个下调的m RNA(倍数变化≥2,P<0.05);(2)m6A修饰位点的表达差异:对大鼠创伤性视神经损伤视网膜组织中m6A修饰的m RNA进行全基因组定位,表达上调的有2810个m6A位点,表达下调的有689个m6A位点(倍数变化≥2,P<0.05),m6A位点主要位于染色体chr1、chr2、chr3和chr10上;(3)GO分析:m6A上调的基因主要与神经组织发育、系统发育、细胞分化等相关,m6A下调的基因主要与细胞定位、细胞大分子定位、蛋白质折叠等相关;(4)KEGG通路分析:视网膜中上调的m6A峰与丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase,MAPK)信号通路、核因子κB(Nuclear factor kappa-B,NF-κB)信号通路、肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor,TNF)信号通路相关,而下调的m6A峰主要与核糖体、内质网蛋白质处理通路、剪接体通路等相关。研究结论:(1)在创伤性视神经损伤发生后,视网膜的m RNA中存在大量m6A位点差异性表达;(2)GO分析、KEGG通路分析提示了m6A修饰可参与视神经损伤的多个部位与多个过程中,AMIGO、SHANK和SLC38A1等基因转录物的m6A修饰改变有成为创伤性视神经损伤诊断、预后评价相关生物标志物的可能,同时有望成为视神经损伤治疗的新靶点。