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目的:(1)原核表达制备重组人精子特异性乳酸脱氢酶(rhLDH-C4)抗原。(2)以rhLDH-C4为包被抗原,建立人血清抗LDH-C4抗体(IgG型)检测的间接ELISA方法,为人血清抗精子抗体(ASA)的检测及免疫不育症的诊断提供新的实验方法。(3)探讨人血清抗LDH-C4抗体IgG与不育症的关系。方法:(1)应用本室构建的pET-28a(+)-hLDH-C重组质粒,转化大肠杆菌Ecol.BL21(DE3)plysS;经菌液PCR及酶切电泳鉴定后,用IPTG诱导rhLDH-C4蛋白的可溶性表达,经Ni+-NTA亲和层析法一步纯化,制备rhLDH-C4抗原;SDS-PAGE鉴定重组蛋白的纯度;乳酸脱氢酶同工酶活性染色检测重组蛋白的酶活性。(2)应用Western blotting从不育患者血清标本中筛选出一例抗LDH-C4抗体阳性的血清标本作为阳性对照,以25例处女血清标本OD测定值确定ELISA的判定临界值(cut-off),建立间接ELISA方法,并优化其它检测参数。(3)应用该ELISA方法,分别检测74例正常男女(生育组)和177例不明原因不育男女(不育组)血清标本中的抗LDH-C4抗体(IgG型)的水平。结果:(1)1000ml菌液经诱导纯化后,得rhLDH-C4蛋白约1.5mg;纯化的rhLDH-C4在SDS-PAGE电泳中仅显示一条区带;乳酸脱氢酶同工酶活性染色显示rhLDH-C4活性区带位于LDH-4附近。(2)ELISA检测参数的确定:rhLDH-C4抗原最适包被浓度为1μg/ml,判定临界值(cut-off)为0.120。(3)血清标本ELISA检测结果:不育组阳性率显著高于正常生育组(30.51%对9.46%,P<0.005);女性不育组阳性率略高于男性不育组,但两组之间差别无显著意义(31.46%对29.55%,P>0.05)。结论:(1)成功地制备了高纯度的rhLDH-C4抗原,该蛋白具有类似天然乳酸脱氢酶同工酶的酶活性。(2)首次建立了人血清抗LDH-C4抗体(IgG型)检测的间接ELISA方法,该方法具有高度的敏感性及特异性。(3)人血清抗LDH-C4抗体IgG与不明原因不育症关系密切。