大鲵是目前现存最大的两栖类,但是由于过度开采,栖息地的丧失,环境的污染,野生大鲵数量急剧下降。大鲵生殖生物学研究对于人工繁育及大鲵资源保护具有重要意义。首先通过解剖学及组织学分析了大鲵雄性性腺发育,其次克隆大鲵UCHL1及ESR1基因、生物信息学分析了二者分子特性;最后通过RT-PCR和RT-qPCR及免疫组织化学方法研究了UCHL1及ESR1在性腺发育过程中的表达和定位,结果如下:1、解剖观察发现,6月龄大鲵性腺呈长条状;12月龄到性成熟前,大鲵睾丸呈长椭圆形、卵巢呈扁平弯曲带状;初步确定大鲵性别分化的时间在6月龄到12月龄之间。H.E.染色结果,6月龄大鲵性腺有大核细胞形成的外壁,中央为单细胞构成的网状腔体;12月龄大鲵睾丸精小叶开始形成,间质组织丰富;在2龄大鲵睾丸精小叶中生殖细胞和体细胞形成生精上皮,精小叶腔出现;3龄大鲵睾丸精小叶数目增多,精小叶腔增大;成年大鲵在繁殖间期,睾丸精小叶中,各级生殖细胞有规律分布,且精小叶顶部出现成熟的精子;繁殖期的睾丸精小叶充满成熟的精子。2、大鲵UCHL1基因全长1087bp,ORF有669 bp,编码222个氨基酸;大鲵UCHL1蛋白有1个O-糖基化位点,14个磷酸化位点;大鲵UCHL1蛋白与人类UCHL1蛋白的同源性最高,达到73.99%。RT-qPCR结果显示,随着雄性性腺的发育,UCHL1 mRNA表达水平在2龄时达到峰值;进一步检测显示繁殖期的UCHL1 mRNA表达显著低于繁殖间期的水平。免疫组织化学表明,在6月龄大鲵性腺中,UCHL1表达于靠近性腺周边的大细胞核中,随着大鲵睾丸的发育,在12月龄大鲵睾丸中,UCHL1定位于精小叶包围的细胞质;在2龄到3龄大鲵睾丸中,UCHL1定位于靠近小叶腔的细胞质和细胞膜中,在成年大鲵睾丸中,UCHL1蛋白分布于精小叶腔内的细胞之间。3、大鲵ESR1基因全长2585bp,ORF有1755bp,编码584个氨基酸;大鲵ESR1蛋白有10个O-糖基化位点,3个N-糖基化位点,59个磷酸化位点;大鲵ESR1蛋白与日本大鲵的ESR1蛋白的同源性最高,达到99%,与哺乳动物同源性70%左右。RT-qPCR结果表明,从12月龄到3龄大鲵睾丸,ESR1mRNA表达呈上升趋势。免疫组化结果显示,在不同发育阶段的大鲵睾丸中,ESR1蛋白均定位在睾丸生殖细胞及间质细胞,成年期的成熟精子没有ESR1表达定位。以上结果表明,初步确定大鲵性别分化时间在6月龄到12月龄之间;在大鲵雄性性腺中,UCHL1有组成型表达(细胞核、细胞质和细胞膜定位)和分泌型表达(将生殖细胞分隔在不同微环境中),UCHL1可能与大鲵睾丸的发育有关,保证生殖细胞同步发育;ESR1在脊椎动物中是高度保守的,在大鲵睾丸中,ESR1蛋白均定位于生殖细胞及间质细胞,可能参与维持大鲵生殖细胞的生存及正常的精子发生。