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肌肉抑制素基因编码的肌肉抑制素蛋白(英文名称Myostatin，MSTN)，是改良家畜肉质品质的重要候选基因，对肌肉生长起负调控作用，MSTN敲除动物肌肉表型为“双肌型”。它的药理作用具有潜在的医学价值，很有希望运用于治疗肌肉萎缩症，尤其是潜在的治疗心机萎缩的功能。另有研究表明，抑制动物MSTN的表达，增强了动物胰岛素敏感性，提高了糖的摄取能力，可治疗Ⅱ型糖尿病；抑制 MSTN的表达，动物相对脂肪含量降低，可有效的改善其血脂异常和动脉粥样硬化。MSTN敲除细胞模型，可运用于相关新药物的研发及 MSTN功能的进一步研究。 本研究通过 CRISPR/Cas9介导的同源重组将标记基因插入靶位点，失活第一条 MSTN等位基因，通过标记基因筛选甄别，筛选带阳性标记的克隆，完成第一次打靶；利用 Cre/LoxP删除系统，删除阳性标记基因，排除了标记基因对MSTN第二条等位基因打靶试验的干扰；同样，通过 CRISPR/Cas9介导的同源重组将标记基因插入靶位点，失活第二条 MSTN等位基因，通过筛选标记基因甄别技术，筛选带阳性标记的克隆，完成第二次打靶。经过电转染，G418抗性筛选，荧光显微镜、流式细胞仪对荧光蛋白标记进行筛选甄别；通过 PCR产物凝胶电泳，PCR产物测序，Southern印迹和Western印迹验证。试验结果综合分析表明：第一次打靶试验，获得了带阳性标记的MSTN单等位基因敲除细胞系PK3108；删除标记试验，获得了不带标记 MSTN单等位基因敲除的细胞系PK3108-1，PK3108-2，PK3108-3；第二次打靶试验，获得了带阳性标记的MSTN双等位基因敲除细胞系L18。 本研究运用CRISPR/Cas9和Cre/LoxP技术成功地体外构建了猪肌肉抑制素双等位因敲除细胞模型，为体外实现细胞的双等位基因敲除提供了可参考的技术路线；获得的MSTN单等位、双等位敲除细胞系，为相关疾病新药物的开发及MSTN功能进一步研究提供了细胞模型。综上所述，本研究为体外双等位基因敲除细胞模型的构建提供了新的可参考的技术路线，对于猪育种畜牧业的发展，以及对于骨骼肌、心肌病理学，对于治疗Ⅱ型糖尿及改善血脂异常和动脉粥样硬化的研究具有非常重要的意义。