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脂蛋白(lipoprotein)是富含脂质的颗粒,表层含蛋白质(载脂蛋白)和极性脂质(磷脂和未脂化的胆固醇),其非极化脂质核心含甘油三酯和胆固醇酯。各种脂蛋白所含脂类和蛋白质的量各不相同,其密度亦各不相同,经密度梯度离心,脂蛋白可分为四类:乳糜微粒(CM)、极低密度脂蛋白(VLDL)、低密度脂蛋白(LDL)和高密度脂蛋白(HDL)。CM内所含胆固醇(CH)很少,是外源性脂肪的主要运输形式。VLDL胆固醇的含量也较少,它是内源性脂肪的主要运输形式。LDL含量较少,但胆固醇和磷脂的含量较高,是将肝脏合成的内源性胆固醇转运至周围的主要形式,并调节胆固醇的合成。HDL是肝脏合成的密度较高、颗粒较小的脂蛋白,其包含的脂质主要是磷脂、CH、胆固醇酯和TG。
在本实验室的家蚕蛹cDNA文库中,我们发现了四条编码家蚕载脂蛋白的cDNA序列。其中一条,通过NCBI里的blast比对,发现它含有917个碱基,其ORF为786个碱基,是一个完整的编码框,编码261个氨基酸,预测该蛋白的分子量为30.013kDa,等电点为7.193。其命名为Bomby.mor.lipoprotei.pBmHPC-23(BmLp-c23),GenBank登录号为EU024295。将PCR扩增所得目的基因完整的ORF,经Ba.HI和Hin.III双酶切后,插入融合表达载体pET-28a(+)的相应酶切位点,成功构建重组融合蛋白表达质粒pET-28a.BmLp-c23,并转化感受态大肠杆菌BL21(DE3),经PCR、酶切鉴定以及测序分析证实重组成功。
将该重组子转化大肠杆菌BL21(DE3),用终浓度为.mM的IPTG诱导重组菌后,裂解菌体作SDS-PAGE分析,在33kDa左右的位置有一条特异性蛋白条带,与预期值(融合标签3.5.kDa,BmLp-c2.30,01.kDa)相符。但是融合蛋白以包涵体的形式存在。将包涵体洗涤,溶解处理后,发现难溶于包涵体溶解液中。但是,发现一个很重要的现象,虽然目的蛋白无法溶解于此溶解液中,而菌体的那些杂蛋白却可以有一定的溶解。按此思路纯化融合蛋白。将包涵体反复用此溶解液溶解,以去除杂蛋白。融合蛋白纯化后的纯度约为90%。以纯化所得蛋白为抗原免疫雄性新西兰兔,制备了该重组蛋白的多克隆抗体,用ProteinA凝胶柱纯化多克隆抗体,ELISA检测该抗血清的效价可达到1:8000以上。提取家蚕五龄幼虫的各组织蛋白,用于Wester.blotting实验。实验结果表明,BmLp-c23蛋白在家蚕的性腺、气管、马氏管、表皮、脂肪体组织中都有表达,而在丝腺、肠、头中我们并没有检测到该蛋白的存在。亚细胞定位结果表明,该蛋白在细胞质和细胞核内都有。我们还利用荧光定量PCR的方法,对家蚕卵、五龄幼虫、蛹、蛾等发育时期,以及五龄幼虫各组织中的靶mRNA的量进行比较。