[目的]NaN3(sodium azide,NaN3)是一种剧毒物质,在其生产、加工过程中可通过人体呼吸道、消化道、皮肤吸收引起急、慢性中毒,导致全身多系统损伤。在人体各个组织器官中,神经系统的耗氧量巨大,对缺氧最敏感,耐受性最小,反应最剧烈,是NaN3主要的毒性靶器官。目前已有多项研究显示NaN3急性中毒可诱导大鼠脑、尾-壳核、大脑皮层、海马、小脑皮层和丘脑发生病理改变,同时伴有大鼠脑内神经元的凋亡。本实验以大鼠为研究对象及PC12细胞为脑内多巴胺能神经元模型,研究NaN3对大鼠纹状体神经元及PC12细胞凋亡的作用及潜在的作用机制。[方法]动物实验:32只实验SD雄性大鼠随机分为4组,每组8只,分为对照组、NaN3低剂量组(1.5mg/kg)、中剂量组(3mg/kg)及高剂量组(6mg/kg)进行腹腔注射,每日6次,每次注射间隔0.5h,连续6天,对照组大鼠给予同等体积的生理盐水作为实验对照。观察各组大鼠的中毒症状,给药后的第7天,各组大鼠经眼眶取血及心脏灌注固定,检测各组SD大鼠血液中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽(glutahione,GSH)及乳酸脱氢酶(Lactate Dehydrogenase,LDH)的活性。取脑组织中纹状体进行HE染色并观察其病理改变,应用免疫组织化学法检测凋亡相关基因 Caspase-3,B-cell lymphoma 2(Bcl-2),Bcl-2-associated X protein(Bax)及细胞色素 C(cytochrome c,Cyt-c)蛋白的表达。体外实验:采取不同浓度(0,5,10,20,40 and 80 mM)的NaN3分别诱导PC12细胞(12,24,48和72 h)后检测PC12细胞存活率,建立神经细胞凋亡模型。不同浓度的NaN3分别诱导PC12细胞(12,24,48和72 h)后,使用CCK-8细胞计数试剂盒检测PC12细胞在不同时间点的存活率。DAPI染色在荧光显微镜下观察凋亡细胞及其细胞核形态的变化,使用Annexin V-FITC和PI双染、mitochondrial membrane potential(△Ψm)试剂盒,通过流式细胞仪检测各处理组的PC12细胞凋亡率及其线粒体膜电位的变化。同时使用含DCFH-DA荧光探针的试剂盒检测各处理组的PC12细胞中活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平。使用ATP检测试剂盒通过Luminometer检测各处理组PC12细胞中ATP的水平。收集各组PC12细胞,提取细胞总蛋白,采用western-blot方法检测各处理组PC12细胞内B-cell lymphoma 2(Bcl-2),Bcl-2-associated X protein(Bax),procaspase-3,细胞色素 C(cytochrome c,Cyt-c),过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅酶激活因子(peroxisome proliferator-activated receptor γco-activator 1-α,Pgc-1α),核呼吸因子(nuclear respiratory factor,Nrf-1/2),线粒体转录因子(mitochondrial transcription factor A,Tfam),线粒体呼吸链复合物Ⅳ(complexⅣ,Cox Ⅳ),磷酸酶钙神经素(pan-calcineurin A,CaN),钙调蛋白依赖性蛋白激酶(phosphorylated(p)-Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase,Camk),P38 胞外信号调节蛋白激酶(p-p38 mitogen-activated protein kinase,p38MAPK)及细胞外信号调节激酶(p-extracellular signal-regulated kinase,Erk1/2)蛋白的表达。[结果]一、动物实验结果:(1)随着对染毒大鼠给药次数的增加和时间的延长,各个剂量组的大鼠均出现不同程度的肢体活动次数减少、反应迟钝、嗜睡、饮食摄入量减少等表现。其中低剂量组于染毒的第4d给药时发生中毒,染毒大鼠首先出现呼吸频率加快,随即开始躁动不安,步态有些蹒跚,但很快进入抑制状态,表现为俯卧不动或者侧卧,期间可出现轻度的肢体抽搐和震颤,但其中毒症状持续一段时间后仍可恢复。中剂量组和高剂量组分别于染毒的第3d和第2d出现上述的症状,症状的持续时间较低剂量组虽然有明显延长,但仍可恢复。高剂量组中则于染毒的第5d和第6d分别有一只大鼠死亡。(2)与对照组相比,各个剂量的NaN3处理组中,大鼠的SOD、GSH活性明显降低,LDH活性显著增高(P<0.01)。(3)HE结果显示:对照组纹状体神经细胞形态正常,数量多,分布均匀,神经细胞排列紧密;给药组细胞排列紊乱、疏松、形态不规则,神经元细胞胞浆呈深染,细胞核固缩,神经纤维束疏松肿胀,重者呈网眼状,神经元数量明显减少。(4)免疫组织化学染色结果显示:与对照组相比,随着染毒次数的增加和时间的延长,各个剂量组的Bax、Caspase-3及Cytochrome c阳性细胞数逐渐增加(P<0.01),而Bcl-2的阳性细胞数逐渐减少(P<0.01).二、体外实验结果:(1)CCK-8检测结果显示:不同给药浓度(0,5,10,20,40,80 mM)的NaN3处理PC12细胞(12-72h)后,其细胞死亡率随着给药时间的延长和给药剂量的增加而增加,在20mM浓度的NaN3处理PC12细胞24h后,PC12细胞接近半数死亡,其存活率达24.89±3.33%。实验结果提示:NaN3对PC12细胞的抑制作用呈时间和剂量的依赖性。(2)DAPI染色结果显示:不同浓度(0,10,20,40mM)的NaN3处理PC12细胞24h后,在荧光显微镜下观察发现:NaN3给药组的部分细胞核体积变小,荧光强度增强,部分细胞呈碎块状致密浓染,颜色发白,且随着给药浓度的增加,凋亡的细胞数逐渐增多,而对照组的细胞核较大,核大小及其染色均匀、染色较浅。(3)Annexin V-FITC和PI双染进一步检测细胞凋亡结果显示:(10,20,40mM)的NaN3处理PC12细胞24h后,细胞的凋亡率分别为:8.2±0.14%、43.77±10.28%、78.67±13.92%,8.20%,而对照组的凋亡率为5.03±1.38%,差异显著(P<0.05),有统计学意义。实验结果提示:NaN3能够诱导PC12细胞的凋亡,且随着给药浓度的增高,凋亡率显著增加。(4)流式细胞仪检测 mitochondrial membrane potential(△Ψm)的结果显示:(0,10,20,40mM)的NaN3处理PC12细胞24h后,其红/绿荧光的比值分别为:1.84±0.01,1.74±0.2,1.66±0.1,0.32±0.1,与对照组相比较,差别有统计学意义(P<0.05)。实验结果提示:NaN3能够降低PC12细胞中线粒体的膜电位。(5)流式细胞仪检测PC12细胞中活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平结果显示:(0,10,20,40mM)的NaN3处理PC12细胞24h后,其平均荧光强度值分别为:3.65±0.28,6.99±1.06,18.63±4.27,39.35±6.85.与对照组相比较,差异显著(P<0.01),有统计学意义。实验结果提示:NaN3能够大幅度的增加PC12细胞中的活性氧水平。(6)Luminometer 检测 PC12 细胞中 ATP 结果显示:(0,10,20,40mM)的 NaN3处理PC12细胞24h后,其细胞中的ATP含量分别为:0.21±0.02 nmol/mg,0.11±0.02 nmol/mg,0.07±0.01 nmol/mg,0.04±0.008nmol/mg.与对照组相比较,差异显著(P<0.05),有统计学意义。实验结果提示:NaN3能够降低PC12细胞中的ATP水平。(7)Western blot结果显示:与对照组相比较,随着给药组浓度的增高,给药组中 procaspase-3,Pgc-1α,Nrf-1/2,Tfam,Cox Ⅳ,p-Erk/Erk 的表达逐步下降,而Bax/Bcl-2,cytochrome c、Pan-calcineurinA,p-Camk Ⅱ/Camk Ⅱ,p-p38MAPK/p38MAPK的表达逐步升高(P<0.05).结论:NaN3腹腔注射能够成功复制大鼠中毒模型,并损伤大鼠模型中的纹状体形态结构,诱导纹状体神经元的凋亡;在其细胞毒性模型中证实:NaN3能够抑制PC12细胞增殖,呈浓度依赖趋势,并可诱导PC12细胞凋亡,该作用可能与其能够降低其细胞中线粒体的膜电位、ATP水平及活性氧水平的增加有关。多种因素共同作用于Pgc-1α信号通路的活化和调节可能是其分子机制之一。