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第一部分脑内注射不同α-synuclein原纤维诱导的病理改变和腺苷A2A受体上调 目的:用野生型(wild-type,WT)及A53T突变型α-synuclein(α-Syn)分别进行脑内注射制作突触核蛋白病小鼠模型,观察两种α-Syn诱导的病理改变和腺苷A2A受体(adenosine A2A receptor,A2AR)的表达,为突触核蛋白病的早期诊断寻找新的生物标记物。 方法:利用基因工程技术体外人工合成WT及A53Tα-Syn原纤维,健康成年雄性C57BL/6小鼠96只,体质量22-26 g,随机分为A、B、C、D四组,每组24只,分别进行纹状体、海马、皮层及黑质四个脑区的单侧立体定位注射造模,A、B、C、D每组再随机分为1、2、3三组,每组8只,分别注射A53Tα-Syn原纤维、WTα-Syn原纤维及无菌PBS。一个月后取造模鼠脑组织进行检测,采用免疫组织化学及免疫荧光染色观察注射脑区及相关脑区的磷酸化α-Syn(pSyn)免疫活性变化,评价α-Syn病理包涵体的形成情况;采用免疫荧光染色观察注射脑区胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)及核因子κB(nuclear factorκB,NF-κB)的表达情况,评价胶质反应及炎症反应情况;采用TUNEL染色检测注射脑区细胞凋亡情况;纹状体造模鼠采用免疫荧光染色观察纹状体区γ H2A.X的表达,评价DNA双链断裂(double strand breaks,DSBs)情况;黑质造模鼠采用免疫荧光染色观察黑质致密部酪氨酸羟化酶(tyrosinehydroxylase,TH)的免疫活性变化,评价多巴胺能神经元受损情况;采用免疫荧光染色、蛋白质免疫印迹(Western blot,WB)、实时定量PCR(real-time quantitativePCR,RT-qPCR)检测注射脑区A2AR有无表达上调;海马造模鼠采用免疫荧光双标染色分析α-Syn包涵体和A2AR诱导表达的细胞类型以及两者之间的关系。 结果: 1.各脑区造模鼠A53Tα-Syn组及WTα-Syn组在注射脑区均有pSyn阳性包涵体形成,且A53Tα-Syn组pSyn阳性细胞百分比显著高于WTα-Syn组(p<0.05)。pSyn阳性包涵体大部分与神经元核抗原(neuronal nuclear antigen,NeuN)共定位,少部分与GFAP和Iba-1共定位。 2.海马、皮层、黑质造模鼠A53Tα-Syn组注射脑区GFAP和NF-κB表达水平均显著高于WTα-Syn和PBS组(p<0.05)。 3.海马、皮层、黑质造模鼠A53Tα-Syn组及WTα-Syn组均有TUNEL阳性染色,且A53Tα-Syn组TUNEL阳性细胞数显著高于WTα-Syn组(p<0.05)。 4.纹状体造模鼠A53Tα-Syn组纹状体区γH2A.X阳性细胞数显著高于WTα-Syn组,黑质造模鼠A53Tα-Syn组黑质区TH阳性细胞数显著低于PBS组(p<0.05)。 5.海马、皮层、黑质造模鼠A53Tα-Syn组注射脑区A2AR表达水平均显著高于WTα-Syn和PBS组(p<0.05),WTα-Syn和PBS组则无显著性差异。A2AR染色与NeuN、GFAP、Iba-1染色均存在共定位,与pSyn染色也有较好的共标。 结论:A53Tα-Syn脑内注射较WTα-Syn诱导更明显的神经退行性变,这一过程伴随A2AR表达的显著上调,提示异常上调的A2AR可作为一个新的突触核蛋白病的生物标记物。 第二部分腺苷2A受体敲除对突触核蛋白病小鼠模型的作用 目的:用WT及A2AR敲除(knockout,KO)小鼠分别进行A53Tα-Syn脑内注射制作突触核蛋白病动物模型,观察两种小鼠发生的行为学及病理改变,探寻A2AR在突触核蛋白病中的确切作用,推进突触核蛋白病发病机制的研究,并为A2AR信号通路作为疾病有效的治疗靶点提供理论基础。 方法:健康成年雄性A2AR KO小鼠及其同窝出生仔WT小鼠各32只,体质量22-26 g,两种基因型小鼠各随机分为A、B两组,每组16只,A组进行双侧纹状体注射造模,B组进行双侧海马注射造模,A组再随机分为1、2两组,每组8只,1组注射A53Tα-Syn原纤维,2组注射无菌PBS,同样B组也随机分为1、2两组,每组8只,1组注射A53Tα-Syn原纤维,2组注射无菌PBS。两个月后所有小鼠先进行旷场试验(open-field test,OFT)和自发交替行为(spontaneous alternation behavior,SAB)试验,然后取脑组织进行检测。采用免疫组织化学方法观察注射脑区及相关脑区的pSyn免疫活性变化,评价α-Syn病理包涵体的形成情况;纹状体造模鼠采用免疫荧光染色观察纹状体区γH2A.X的表达,评价DNA DSBs情况;海马造模鼠采用免疫荧光染色观察海马区GFAP和NF-κB表达情况,用WB检测诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxidesynthase,iNOS)改变,评价胶质反应及炎症反应情况,另外采用TUNEL染色检测细胞凋亡情况;海马造模的WT鼠采用免疫荧光染色检测海马区A2AR有无表达上调。 结果: 1.两个脑区(纹状体和海马)造模的两种基因型小鼠A53Tα-Syn组相较PBS组OFT总运动距离均无显著性差异;两个脑区造模的WT鼠A53Tα-Syn组相较PBS组SAB正确率均有显著降低(p<0.05),而A2AR KO鼠两组SAB正确率无显著性差异。 2.两个脑区(纹状体和海马)造模的WT鼠A53Tα-Syn组相较PBS组注射脑区及相关脑区的pSyn阳性细胞百分比均显著升高(p<0.05),而注射A53Tα-Syn的A2AR KO鼠相较WT鼠pSyn阳性细胞百分比显著降低(p<0.05)。 3.纹状体造模的WT鼠A53Tα-Syn组相较PBS组纹状体区的γH2A.X阳性细胞数显著升高(p<0.05),而注射A53Tα-Syn的A2AR KO鼠相较WT鼠γH2A.X阳性细胞数显著降低(p<0.05)。 4.海马造模的WT鼠A53Tα-Syn组相较PBS组海马区的GFAP、NF-κB和iNOS表达水平显著升高(p<0.05),而注射A53Tα-Syn的A2AR KO鼠相较WT鼠GFAP、NF-κB和 iNOS表达水平显著降低(p<0.05)。 5.海马造模的WT鼠A53Tα-Syn组相较PBS组海马区的TUNEL阳性细胞数显著升高(p<0.05),而注射A53Tα-Syn的A2AR KO鼠相较WT鼠TUNEL阳性细胞数显著降低(p<0.05)。 6.海马造模的WT鼠A53Tα-Syn组相较PBS组海马区的A2AR表达水平显著升高(p<0.05)。 结论:A2AR KO可以逆转A53Tα-Syn脑内注射诱导的认知损害及一系列神经退行性变,提示A53Tα-Syn诱导的异常A2AR信号增高通过调控α-Syn的聚集或直接作用对神经退行性变和认知功能损害发挥双重控制作用,这可能是突触核蛋白病的一个重要发病机制,也为A2AR拮抗剂作为突触核蛋白病的有效治疗药物奠定了理论基础。