研究背景《CA:临床医师癌症杂志》数据显示,2017年中国新增恶性肿瘤患者高达368万例。癌痛是晚期癌症患者最常见的临床症状之一。骨癌痛是一种严重的癌痛,多由原发性骨肿瘤或其他恶性肿瘤转移至骨组织所引起。一旦肿瘤组织侵袭骨骼系统,75%的患者会表现为中度至重度的疼痛和病理性骨折。目前临床上常以非甾体类抗炎药为主,加上各种复合治疗例如强效阿片类镇痛药、放射疗法以及抑制破骨细胞活动的辅助药物二磷酸盐和狄诺塞麦等等。但由于骨癌痛发生机制复杂,临床药物的耐受及剂量依赖性不良反应使得骨癌痛的治疗效果并不理想。因此,深入探讨骨癌痛的病理机制,寻求骨癌痛治疗的新靶点,是目前亟需解决的关键问题。骨癌痛是复杂的慢性疼痛,其发生机制包含外周和中枢两个层面。在外周,骨肿瘤组织中的大量的炎性细胞和肿瘤细胞会分泌各种疼痛相关信号分子激活骨组织中的感觉神经元,或通过酸化微环境以及激活PH敏感的神经元导致疼痛的发生。增强的破骨细胞活动会损伤骨组织,通过激活外周机械敏感性受体导致疼痛的发生。在中枢,脊髓背角接受外周伤害性信息的传入,并将伤害性刺激上传至高位脊髓上中枢神经系统。神经元和胶质细胞的相互作用、广动力范围神经元的兴奋性增强、突触重塑以及中枢神经下行易化系统持续激活等等,这些因素参与中枢敏化的形成,并进一步导致了骨癌痛的发生。近期研究表明,脊髓水平抑制性神经元去抑制会放大疼痛信号并参与慢性疼痛的发生过程。中枢神经系统最重要的抑制性中间神经元--γ-氨基丁酸(GAB A)能神经元表达减少会导致慢性疼痛的发生。鞘内注射GABA类似物加巴喷汀或GABA可以有效的缓解外周神经损伤导致的痛觉过敏。骨癌痛是慢性疼痛的重要组成部分,我们推测脊髓中GABA能神经元的减少可能参与骨癌痛的发生。与此同时,大量研究表明在轴突切断术、细胞因子作用、电活动增强等病理过程中,特异性神经元表面MHC-Ⅰ分子mRNA和蛋白表达增高。高表达MHC-Ⅰ分子的神经元容易受到CD8+T细胞的攻击并最终导致神经元的凋亡。因此我们推测骨肿瘤引起MHC-Ⅰ分子高表达于GABA能神经元的表面,并通过促进GABA能神经元凋亡参与骨癌痛的发生。为了证实这一假说,本实验通过胫骨注射Walker256乳腺癌细胞构建大鼠骨癌痛模型,采用基因沉默技术、行为学以及一系列分子生物学方法来探讨MHC-Ⅰ分子在骨癌痛发生过程中的作用机制,为研发以机制为导向的靶向药物提供理论依据。研究方法与结果1.MHC-Ⅰ参与骨癌痛发生方法选择雌性SD大鼠,随机分成假手术组(Sham)、骨癌痛组(Tumor)、骨癌痛+阴性对照病毒组(Tumor+NC-LV)、骨癌痛+MHC-Ⅰ干扰慢病毒组(Tumor+RNAi-LV),其中 Tumor+NC-LV 和 Tumor+RNAi-LV 组在骨癌痛模型建造前3天分别进行脊髓内立体定位注射阴性对照慢病毒和MHC-Ⅰ干扰慢病毒。骨癌痛模型建立后每隔3天进行大鼠痛阈行为学测定。在术后7天、14天、21天采用real-time PCR、western blot以及免疫荧光标记等方法来检测脊髓组织中MHC-Ⅰ的表达变化及MHC-Ⅰ与GABA能神经元共表达的情况。结果行为学结果显示,骨癌痛大鼠在模型建立后9天痛阈明显下降。MHC-Ⅰ干扰慢病毒能够有效的抑制骨癌痛大鼠的痛觉过敏。real-time PCR、western blot结果显示,骨癌痛大鼠脊髓MHC-Ⅰ表达增加,而脊髓内立体定位注射MHC-Ⅰ干扰慢病毒能够有效的抑制骨癌痛大鼠脊髓中MHC-Ⅰ的表达增加。免疫荧光结果显示,骨癌痛大鼠脊髓背角MHC-Ⅰ表达上调并与GABA能神经元共表达。2.MHC-Ⅰ通过促进GABA能神经元的凋亡参与骨癌痛的发生方法选择雌性SD大鼠,随机分成假手术组(Sham)、骨癌痛组(Tumor)、骨癌痛组+阴性对照病毒组(Tumor+NC-LV)、骨癌痛组+MHC-Ⅰ干扰慢病毒组(Tumor+RNAi-LV),其中 Tumor+NC-LV 和 Tumor+RNAi-LV 组在骨癌痛模型建造前3天分别进行脊髓内立体定位注射阴性对照慢病毒和MHC-Ⅰ干扰慢病毒。骨癌痛模型建立后每隔3天进行大鼠痛阈行为学测定。在术后7天、14天、21天采用western blot、免疫荧光双标等方法来检测脊髓组织中GABA能神经元和活化的caspase 3的表达变化及活化的caspase 3与GABA能神经元共表达的情况。原位缺口末端标记染色(TUNEL)法检测GABA能神经元的凋亡。结果:real-time PCR、western blot结果显示,骨癌痛大鼠脊髓GABA能神经元特异性标记物谷氨酸脱羧酶65+67(GAD65+67)表达降低,活化的caspase3表达增加,而脊髓内立体定位注射MHC-Ⅰ干扰慢病毒能够有效的抑制骨癌痛大鼠脊髓GAD65+67蛋白的降低和活化的caspase 3蛋白的增加。TUNEL染色结果显示,骨癌痛大鼠脊髓背角GABA能神经元凋亡,脊髓内立体定位注射MHC-Ⅰ干扰慢病毒能够有效的抑制骨癌痛大鼠脊髓GABA能神经元的凋亡。免疫荧光结果显示,骨癌痛大鼠脊髓背角活化的caspase 3阳性细胞表达增加并与GABA能神经元共定位。3.GABA能神经元凋亡与中枢CD8+T细胞浸润相关方法选择雌性SD大鼠,随机分成假手术组(Sham)、骨癌痛组(Tumor),构建模型。在术后7天、14天、21天采用流式细胞学、western blot以及免疫荧光双标等方法来检测脊髓组织中CD8+ T细胞的表达变化及MHC-Ⅰ与CD8+ T细胞、CD8+ T细胞与GABA能神经元共表达的情况。结果流式细胞学和western blot结果显示,骨癌痛大鼠脊髓中CD8+ T细胞表达增加。免疫荧光结果显示,骨癌痛大鼠脊髓背角CD8+T细胞表达增加,且CD8+T细胞与MHC-Ⅰ共表达、CD8+ T细胞与GABA能神经元共表达。4.统计学分析运用统计软件SPSS(V16.0)进行数据分析,计量资料用均数±标准差表示(x±s)。组间比较采用单因素方差或双因素方差分析(ANOVA),分析后采用Bonferroni post-hoc检验,P<0.05为差异有统计学意义。研究总结一、主要研究结果1.骨癌痛大鼠脊髓中MHC-Ⅰ表达增加,与GABA能神经元共表达。脊髓内立体定位注射MHC-Ⅰ干扰慢病毒能够有效的抑制骨癌痛大鼠脊髓中MHC-Ⅰ的表达增加,并能够有效的缓解骨癌痛大鼠的痛觉过敏。2.骨癌痛大鼠脊髓中GABA能神经元发生凋亡,脊髓内立体定位注射MHC-Ⅰ干扰慢病毒能够有效的抑制骨癌痛大鼠脊髓中GABA能神经元凋亡。3.骨癌痛大鼠脊髓中活化的caspase 3表达增加,与GABA能神经元以及TUNEL阳性细胞共表达,脊髓内立体定位注射MHC-Ⅰ干扰慢病毒能够有效的抑制骨癌痛大鼠脊髓中活化的caspase 3的表达增加。4.骨癌痛大鼠脊髓背角CD8+ T细胞表达增加,且CD8+ T细胞与MHC-Ⅰ共表达、CD8+ T细胞与GABA能神经元共表达。二、研究结论1.骨癌痛大鼠脊髓背角GABA能神经元上MHC-Ⅰ表达增加。2.MHC-Ⅰ通过活化的caspase 3途径促进脊髓背角GABA能神经元的凋亡。3.MHC-Ⅰ干扰慢病毒能够有效的抑制GABA能神经元的凋亡从而有效的缓解骨癌痛大鼠的痛觉过敏。4.MHC-I引起的GABA能神经元的凋亡可能与脊髓中浸润的CD8+ T细胞有关。三、创新之处1.本研究首次证实了 MHC-I可以通过促进大鼠脊髓背角GABA能神经元的凋亡参与骨癌痛的发生,揭示了骨癌痛发生的又一分子机制。2.本研究首次证实了骨癌痛大鼠脊髓浸润CD8+T细胞,为后期继续探讨骨癌痛的神经免疫学机制提供新方向。四、展望1.本研究证实了 MHC-I可以通过促进脊髓背角GABA能神经元的凋亡参与骨癌痛的发生机制,并应用基因沉默RNA干扰技术下调MHC-I的表达,部分缓解了骨癌痛的发生。这一机制的发现可以为分子靶向药物的研发提供理论依据。但该分子靶点用于临床治疗骨癌痛的可行性和安全性仍有待于进一步的研究和论证。2.本研究证实骨癌痛大鼠脊髓中CD8+ T细胞表达增加,MHC-I引起的GABA能神经元的凋亡可能与脊髓中浸润的CD8+ T细胞有关。但CD8+ T细胞攻击GABA能神经元参与骨癌痛的发生机制仍需要深入研究。