酱香风味的组成成分及其产生机制一直是酱香型白酒的热门研究内容。目前,关于吡嗪类物质的前体物质乙偶姻的研究已有诸多报道,关于其前体物质氨的研究甚少,在微生物发酵过程中氨基酸的相关功用尚不明确。因此,本文用一株产酱香浓郁的枯草芽孢杆菌对酱香模拟曲进行酱香模拟发酵,对发酵物中的游离氨基酸成分进行了检测与分析,并通过对2,5-二甲基吡嗪前体氨基酸——苏氨酸的合成途径解析,对苏氨酸代谢为2,5-二甲基吡嗪途径中的关键酶进行了基因敲除,以验证其在微生物发酵过程中对吡嗪类物质生成的影响,进而了解苏氨酸对酱香风味形成的影响,主要研究内容及结果如下:1、选用贵州大学微生物实验室保存的5株菌株对已实验证实、能使产酱香菌株明显产生浓郁酱香风味的模拟酱香曲——黄豆发酵培养基进行产酱香升温发酵,发酵结束后由实验室研究人员嗅闻发酵物气味、观察褐变程度,筛选出产酱香浓郁的菌株Bacillus subtilis E20做实验菌株,同时筛选出产酱香味最淡的Bacillus subtilis 168做对照菌株。2、使用产酱香浓郁的菌株Bacillus subtilis E20和产酱香不突出的Bacillus subtilis 168分别对黄豆发酵培养基、高粱小麦1:1混合物发酵培养基进行酱香模拟发酵,通过OPA-FMOC柱前衍生化测定发酵物中的游离氨基酸。在所有发酵物中均检测出16种氨基酸,胱氨酸未检测到,因发酵基质的不同,发酵物中游离氨基酸的组成和差异较大;相同发酵培养基经不同处理酱香模拟发酵后,发酵物的游离氨基酸的组成也有所差异。3、对由苏氨酸代谢合成2,5-二甲基吡嗪过程中的关键酶——苏氨酸脱氢酶基因（tdh）进行基因克隆。以Bacillus subtilis E20 DNA为模板,通过设计特异性扩增引物,对E20-tdh基因进行扩增后将其与克隆载体p MD18-T连接然后转化至E.coli DH5α细胞获得tdh基因克隆菌株。据测序结果显示,tdh基因全长为1044bp,共编码347个氨基酸,与来自于Bacillus subtilis 168菌株的tdh基因（NCBI登录号:CP053102）的相似度为99.04%。E20 tdh基因编码产物苏氨酸脱氢酶蛋白（TDH）与枯草芽孢杆菌的TDH蛋白（NCBI登录号:WP＿128441634）的相似度为99.42%。4、对E20菌株的TDH蛋白进行相关的生物信息学分析。E20-TDH蛋白分子量约为37KDa,p I理论值为5.94,不稳定指数为31.27,属于稳定的可溶性疏水蛋白,不含信号肽,不在细胞内进行跨膜转运,极有可能定位在细胞周质。该蛋白催化苏氨酸和NAD生成L-2-氨基乙酸乙酯和NADH,活性位点可能位于67-81的氨基酸序列,有四个保守结构域。二级结构预测显示α-螺旋占比31.99%,β-转角占比9.51%,延伸链占比22.48%,无规卷曲占比36.02%。与菌株168TDH蛋白相比,两者在蛋白分子量、理论p I、不稳定系数、二级结构、三级结构上有差异。5、以Bacillus subtilis E20 DNA为模板,设计含有酶切位点的引物进行PCR扩增,与表达载体p ET-22b（+）连接后转化至E.coli BL21（DE3）感受态细胞,获得含tdh基因的表达菌株E.coli BL21/p ET22b-tdh。经不同培养时间、不同培养温度及不同浓度诱导剂（IPTG）诱导后,提取粗酶液进行SDS-PAGE检测并对电泳条灰度值进行分析,结果表明最适诱导条件为:温度25℃、诱导剂IPTG浓度0.5mmol/L、诱导时间12h,在该诱导条件下诱导原核表达菌株E.coli BL21/p ET22b-tdh表达,经SDS-PAGE检测,目的蛋白主要以包涵体形式存在。6、以p UC18载体为基础骨架,设计含有酶切位点的引物从Bacillus subtilis 1S101 DNA特异性扩增得到氯霉素基因（cat）作为抗性筛选标记基因,同时设计两对含有酶切位点的引物,以基因敲除目的菌株E20的DNA为模板,通过PCR技术扩增出同源左臂和同源右臂,通过酶切、连接成功重组构建了tdh基因敲除质粒p UC18-HL-CAT-HR。7、通过化学转化法将敲除tdh基因的敲除质粒p UC18-HL-CAT-HR转化进Bacillus subtilis E20感受态细胞中并获得了tdh基因敲除的E20菌株,将其命名为E20-Δtdh。利用E20-Δtdh菌株进行酱香模拟发酵,通过感官评价发现,E20-Δtdh菌株的发酵物同野生菌株E20相比,两者褐变一致,均有一定的粘度产生,E20-Δtdh菌株发酵物中的酱香味变淡,有较E20突出的浓厚的焦糊味。应用HS-SPME-GC/MS检测黄豆发酵物挥发性风味成分,结果表明tdh基因敲除后,黄豆发酵物中吡嗪类物质相对含量大大减少,四甲基吡嗪的含量比野生菌株E20发酵物中的多,未检测到在野生菌株E20发酵物中有较高含量的2,5-二甲基吡嗪,推测对酱香风味产生影响的吡嗪类物质可能主要是2,5-二甲基吡嗪,进而说明了苏氨酸可能主要是通过代谢为2,5-二甲基吡嗪来影响酱香风味的形成,2,5-二甲基吡嗪相对含量的多少与酱香风味的浓郁与否呈正相关关系。