【摘 要】
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目的:通过体内实验探讨SPAG6通过mTOR促进食管癌细胞恶性进展的机制。方法:1.采用慢病毒质粒稳定转染方法,构建空白对照组、空载组及稳定敲低SPAG6组的KYSE-150和Eca-9706食管癌细胞株;荧光显微镜下观察荧光情况,验证转染效率;提取上述三组细胞的蛋白,Western blot验证SPAG6蛋白表达情况。2.将上述三株细胞接种于裸鼠体内,分别构建三株细胞的裸鼠皮下成瘤模型、尾静脉肺
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目的:通过体内实验探讨SPAG6通过mTOR促进食管癌细胞恶性进展的机制。方法:1.采用慢病毒质粒稳定转染方法,构建空白对照组、空载组及稳定敲低SPAG6组的KYSE-150和Eca-9706食管癌细胞株;荧光显微镜下观察荧光情况,验证转染效率;提取上述三组细胞的蛋白,Western blot验证SPAG6蛋白表达情况。2.将上述三株细胞接种于裸鼠体内,分别构建三株细胞的裸鼠皮下成瘤模型、尾静脉肺转移模型和脚垫淋巴道转移模型;3.采用q RT-PCR、Western Blot、免疫组织化学染色方法检测三种动物模型中各组皮下成瘤动物组中瘤体中SPAG6、mTOR、LC3B、ATG5和P62的mRNA和蛋白表达水平的差异、尾静脉肺转移模型中转移瘤数目的差异及脚垫淋巴道转移组中淋巴结肿瘤转移数目的差异。结果:1.荧光及Western Blot检测结果显示,食管癌KYSE-150和Eca-9706细胞株中慢病毒稳定敲低SPAG6模型构建成功;2.食管癌Eca-9706细胞株SPAG6稳定敲低组裸鼠皮下成瘤模型构建成功,食管癌细胞组异种移植瘤的最终重量和生长体积明显低于空白和空载体对照组。尾静脉肺转移模型和脚垫淋巴道转移模型构建失败;3.Western blot和免疫组织化学染色结果显示,SPAG6敲低组异种移植瘤中SPAG6、mTOR、LC3B和ATG5蛋白表达显著低于空白组和空载体组;而P62蛋白表达显著高于空白组和空载体组;4.qRT-PCR实验结果显示,SPAG6敲低组异种移植瘤中SPAG6、mTOR、LC3B和ATG5的mRNA相对表达水平显著低于空白组和空载体组;而P62的mRNA相对表达水平显著高于空白组和空载体组。结论:1.在食管癌Ec9706细胞中稳定敲低SPAG6,可以在裸鼠体内成瘤,且明显抑制肿瘤的体积和重量。2.动物水平验证SPAG6可能通过mTOR发挥癌基因的作用。3.动物水平验证SPAG6 shRNA可能是一种潜在的mTOR抑制剂,在食管癌的靶向治疗中具有潜在应用价值。
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