论文部分内容阅读
肝细胞癌(Hepatocellular Carcinoma,HCC)是主要的恶性肿瘤,在全球恶性肿瘤中排列第六,在我国发病率高居不下,严重威胁人类健康。肝癌的发生发展是一个多基因参与、外部环境多因素(包括药物损伤)协同参与的复杂过程。已有文献报道,癌症的发病与线粒体有密切的关系,虽然有关原发性肿瘤中线粒体数量变化的证据较少,但已有很多证据表明癌症中关键的癌基因和抑癌基因通过重要的信号通路调节线粒体的动态变化,线粒体的质量和功能随着肿瘤类型和病患个体的不同而不同。线粒体是胞质内的膜性细胞器,存在于大多数真核细胞中,其大小随着生物、组织和细胞的不同而不同。线粒体中也含有可遗传的DNA,但所含DNA数量远远少于细胞核;所以,线粒体也被认为是细胞内的半自主细胞器。线粒体的主要功能是合成ATP和氧化磷酸化,为细胞存活和代谢提供所需的能量。除了参与能量合成外,线粒体也参与细胞分化、凋亡和细胞间信号转导等过程,是保证机体正常运转的关键细胞器,其数量和功能的变化会严重影响机体的生命活动。线粒体的数量多少一定程度上取决于其新生和自噬之间的竞争调节。自噬是通过溶酶体消除细胞质内多余的蛋白质和功能异常的细胞器,并可以为处在恶劣生长环境中的细胞提供所需能量。线粒体自噬是线粒体发生自体吞噬的过程,以清除受损或者功能异常的线粒体,对维持细胞的生存具有重要意义。有人认为肿瘤中的变化和特定的肿瘤病变相关,这反映了或者有助于发现肿瘤的异质性,目前已知的关于肿瘤细胞中线粒体的质量调节的报道中,有文献证实在不同个体的肿瘤中,线粒体的质量各有不同,研究线粒体在肝细胞癌中的作用,或许有助于肝癌的个体化治疗。RMP(RPB5-Mediating Protein),又被称为URI,是RNA聚合酶II(RNApolymerase II,RNAPII)第5亚基RPB5的调节蛋白,最先在肝癌细胞中筛查出。RMP被广泛的认为在细胞泛素化和转录调节中有重要作用;前期有研究报道,RMP/URI参与mTOR的信号通路,所以RMP可能参与了癌症的发展。近期的研究也表明,RMP/URI在肝细胞癌、卵巢癌和前列腺癌的进程中有重要作用。上述研究结果表明RMP是一个重要的转录调节因子,在肿瘤发生发展进程中起到一定的作用。文献报道,RMP可定位于线粒体上,与蛋白磷酸酶PP1形成复合物,参与BAD的磷酸化调控而改变凋亡的阈值。我们近期的结果显示,RMP经由NF B信号通路调节BAD(主要定位于线粒体)的水平(未发表数据)。以上研究结果显提示,RMP可能经由线粒体途径促进肿瘤的发生发展。试验方法:1、Western Blot方法检测肝癌细胞系中RMP表达情况,并依据RMP表达情况在高表达的细胞系中用sh RMP病毒干扰细胞,建立稳定的对照与干扰表达的细胞系;2、应用CCK-8方法检测RMP干扰表达组与对照表达组细胞的增殖能力;3、细胞代谢呼吸动态检测系统检测线粒体耗氧率;4、电子透射显微镜观察线粒体的数量和密度,定量PCR检测线粒体DNA数量;5、线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1法)检测Huh7con细胞和Huh7shRMP细胞中线粒体膜电位的改变;6、用ROS特异的荧光探DR123针对Huh7con细胞和Huh7shRMP细胞进行染色,然后通过荧光显微镜进行观察;H2DCFA染色后,用流式细胞仪检测Huh7con细胞和Huh7shRMP细胞内ROS的累积;7、Huh7con细胞和Huh7shRMP细胞外转GFP-LC3表达质粒,透射电子显微镜观察自噬小体,Western blot检测Huh7con细胞和Huh7shRMP细胞自噬相关基因的蛋白表达水平。结果:1、肝癌细胞系中RMP在Huh7、HCCLM3细胞系中表达较高;2、Huh7shRMP细胞增殖较Huh7con细胞慢,相同的情况也在HCCLM3con/shRMP细胞中出现;3、Huh7shRMP细胞的基础耗氧率明显低于Huh7con细胞;4、电镜结果显示Huh7shRMP细胞与对照组Huh7con细胞相比,线粒体DNA数减少。5、与Huh7con细胞比较,Huh7shRMP细胞中线粒体膜电位明显发生变化。6、荧光显微镜检测Huh7shRMP细胞中ROS的数量和荧光强度均高于Huh7con细胞;流式细胞计数结果与电镜结果一致;7、Huh7shRMP细胞中自噬小体的数量显著高于Huh7con细胞;并且自噬相关基因LC3-Ⅱ在Huh7shRMP细胞中表达高于Huh7con,证明在RMP干扰细胞中发生了自噬。与线粒体自噬相关的PINK1、Parkin的表达同时也升高。结论:本研究通过建立稳定表达干扰RMP和对照的细胞系研究RMP对肝癌细胞增殖影响,发现干扰RMP可能通过影响线粒体的功能,引起线粒体自噬,从而降低肿瘤细胞的增殖能力。