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目的:探究双氢杨梅素(Dihydromyricetin,DHM)和自由转轮运动通过SIRT1通路激活自噬在快速衰老模型SAMP8(Senescence accelerated mouse prone 8,SAMP8)小鼠脑衰老进程与机制。方法:1.动物实验:双氢杨梅素干预:采用体重为280±20 g的6月龄SPF级雄性SAMP8和SAMR1小鼠各20只,均随机分为4组,分别为模型组(Con)、低剂量组(D1)、高剂量组(D2)、高剂量联合氯喹(Chloroquine,CQ)组(D2Q),每组5只。将所有小鼠进行1周的适应性喂养后,Con组小鼠自然饲养两个月,不做任何干预处理。D1组小鼠进行15 mg/ml/d DHM灌胃,D2组小鼠进行30 mg/ml/d DHM灌胃,D2Q组小鼠进行30 mg/ml/d DHM灌胃联合腹腔注射5 mg/ml/d CQ,干预时间为期两个月。自由转轮运动:采用体重为280±20 g的SPF级6月龄SAMP8小鼠15只,随机分为模型组(Con)、自由转轮组(V)和自由转轮联合氯喹组(VQ)三组,每组各5只,各组均适应性喂养一周。其中Con组自然生长两个月;V组进行2个月的自由转轮运动;VQ组每日腹腔注射氯喹(40mg/kg)联合自由转轮运动干预2个月。两种方式干预完成后,对所有小鼠进行眼球取血,而后采用颈椎脱臼法处死,在冰上分离其海马与大脑皮层组织后立即放入液氮冷冻然后转入-80℃冰箱保存。尼氏染色用于观察海马中神经元结构变化;TUNEL染色检测海马内细胞凋亡水平;透射电镜观察海马中自噬小体、线粒体变化;Western blot检测海马内AD样病理蛋白或衰老相关蛋白的表达以验证SAMP8小鼠脑衰老程度,检测凋亡与自噬相关蛋白的表达,观察其凋亡程度与自噬水平。2.细胞实验:培养神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y),在细胞融合度达到70%左右时接种6孔板。分为对照组(Con)、D-gal诱导衰老组(D-gal)、DHM药物干预组(D-gal+DHM)、SIRT1抑制剂EX527(5mM)干预组(D-gal+EX527(5mM))、DHM联合EX527(5mM)干预组(D-gal+DHM+EX527(5mM))、DHM联合EX527(2mM)干预组(D-gal+DHM+EX527(2mM))。Con组细胞正常培养,D-gal+EX527(5mM)、D-gal+DHM+EX527(5mM)组和D-gal+DHM+EX527(2mM)组分别加入2mL浓度为5mM和2mM的EX527干预1h后,D-gal+DHM组、D-gal+DHM+EX527(5mM)组和D-gal+DHM+EX527(2mM)组加入2mL 12.5mg/ml DHM干预2h。后D-gal、D-gal+DHM组、D-gal+EX527(5mM)组、D-gal+DHM+EX527(5mM)组和D-gal+DHM+EX527(2mM)组用含有40 mg/ml D-gal培养液进行培养。24 h后收集细胞样品,Western blot检测SIRT1的表达水平验证是否通过SIRT1通路,检测自噬及衰老相关蛋白的变化来评估自噬和衰老水平。结果:1.动物实验:双氢杨梅素干预:1)TUNEL染色显示衰老模型组小鼠海马组织细胞凋亡率展现了较高水平,而在高剂量DHM干预情况下,小鼠的海马组织的细胞凋亡率明显降低(p<0.001),联合氯喹处理则明显地阻碍了DHM对细胞凋亡的抑制(p<0.001)。2)尼氏染色结果显示,在衰老模型组小鼠海马中神经元细胞排列疏松,核大都深染,尼氏体数量明显较少。而高剂量DHM干预后小鼠神经元细胞排列更加紧密整齐,尼氏体数量明显增加,海马组织的损伤或丢失有明显缓解,联合氯喹处理后DHM的作用被大大削弱。3)透射电镜结果显示,与模型组相比,高剂量组海马内自噬小体数量增加。4)Western blot结果显示脑衰老模型组小鼠海马中AD病理样蛋白APP、p-Tau/Tau、BACE1蛋白表达水平较高,不同剂量DHM干预后,表达水平均显著下降,相反,氯喹联合DHM干预导致上述病理样蛋白表达又有所增加;两种剂量DHM干预都可抑制衰老相关蛋白诸如Ac-p53(p<0.01、p<0.01)、P16(p<0.01、p<0.001)的表达,联合氯喹后Ac-p53表达水平则上升(p<0.01);在细胞凋亡方面显示,在快速衰老模SAMP8小鼠海马中,两种剂量DHM干预后促凋亡蛋白表现下降(p<0.001、p<0.001),联合氯喹后则表达水平再度上升(p<0.001),抗凋亡蛋白Bcl2高剂量组表达上升(p<0.01),联合氯喹后则表达水平下降(p<0.05);细胞自噬相关蛋白显示,自噬正相关蛋白Beclin1、Atg7在两种剂量DHM干预后表达明显上升(p<0.001、p<0.01)、(p<0.01、p<0.01),加入氯喹后则表达下降(p<0.001)、(p<0.05),与模型组相比两种DHM组中自噬负相关蛋白P62明显下降(p<0.001、p<0.05),提示DHM能够激活细胞自噬,增加自噬溶酶体的降解;另外参与自噬通路相关信号蛋白SIRT1的表达在DHM干预后显著上升(p<0.001、p<0.0001),而氯喹干预后SIRT1表达则明显下调(p<0.001)。自由转轮运动:Western blot结果显示与Con组相比,V组小鼠海马中AD病理样蛋白APP、p-Tau/Tau、BACE1蛋白表达水平明显降低(P<0.01),相反,氯喹联合自由转轮运动干预导致上述病理样蛋白表达有所增加;模型组自噬相关蛋白如LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值、Atg7与Beclin1表达下降,自噬底物P62蛋白表达增加,而自由转轮运动可明显上调上述自噬相关蛋白表达水平而下调P62蛋白表达水平,而VQ组的自噬水平下降;模型组凋亡相关蛋白Bax表达水平上升,Bcl-2水平下降,而V组与Con组相比下调(p<0.01),VQ组升高(p<0.01);与Con组相比,V组凋亡相关蛋白Bax明显下调(p<0.01)而Bcl-2蛋白水平显著升高(p<0.01),而腹腔注射氯喹后结果与之相反。2.细胞实验:Western blot结果表明,D-gal可诱导细胞衰老相关蛋白Ac-p53/P53和P21以及细胞自噬负相关蛋白P62的上调。而在衰老细胞模型中加入DHM可减轻乙酰化P53蛋白的表达(p<0.0001)同时也可上调LC3Ⅱ/Ⅰ的比值,促进P62的降解;显著提高SIRT1的表达(p<0.01)。在衰老细胞模型中加入SIRT1抑制剂EX527,与D-gal+DHM组相比,SIRT1表达明显被抑制(p<0.01),P62表达有所上升,LC3Ⅱ/Ⅰ的表达水平下降,P21及Ac-p53(p<0.001)表达水平上升。与D-gal+DHM组相比,加入抑制剂后D-gal+DHM+EX527(2mM)组SIRT1表达水平下调(p<0.05),D-gal+DHM+EX527(5mM)组和D-gal+DHM+EX527(2mM)组P62表达水平上升(p<0.05、p<0.05),LC3Ⅱ/Ⅰ在D-gal+DHM+EX527(5mM)组表达下降(p<0.05),D-gal+DHM+EX527(5mM)组和D-gal+DHM+EX527(2mM)组乙酰化P53水平上升(p<0.01、p<0.01),D-gal+DHM+EX527(5mM)组P21表达上升(p<0.05)提示自噬被抑制。结论:在快速衰老模型SAMP8小鼠衰老过程中,双氢杨梅素干预能够通过上调SAMP8小鼠海马中SIRT1通路从而激活细胞自噬,下调AD样病理蛋白的表达,抑制细胞凋亡,实现对神经元细胞的保护而最终延缓脑衰老的进程。自由转轮运动可能是通过激活细胞自噬,降低凋亡来减少AD病理样蛋白表达实现对神经元细胞的保护而最终延缓脑衰老的进程。