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研究背景:结直肠癌（Colorectal Cancer,CRC）是全球范围内常见的恶性肿瘤,在肿瘤发病率中位于第三位,致死率位于第二位。尽管近几十年来,由于诊断和治疗的进步,全球CRC患者的生存获益有了显著提高,但是在我国CRC的发病率和死亡率仍处于明显上升趋势。由于CRC患者早期没有明显症状,导致诸多患者确诊时已进入疾病晚期。因此,早期检测和有效的非侵入性生物标志物研发对于促进CRC早期诊断和减轻CRC死亡率至关重要。Micro RNAs（miRNAs）是一系列成熟的小型非编码RNA,通常由21-25个核苷酸组成。它们主要通过直接裂解目标mRNA或抑制蛋白质的生物合成,调节细胞和组织中相关基因的表达。miRNAs与肿瘤发生和发展密切相关,能够在人体体液以及肿瘤组织中检出。由于其被包装在细胞外囊泡,特别是外泌体中或与蛋白质复合物结合,因此循环中的miRNAs非常稳定,使其在肿瘤早期阶段作为非侵入性生物学标志物方面具有优势。目前,miRNAs已被广泛应用于各种实体瘤的诊断和预后。在CRC中,miRNAs与众多信号通路的传递和抑制相关,在诊断、预后及个性化靶向治疗领域具有巨大潜力。尽管少数miRNAs的诊断价值已在先前的研究中得到证实,但仍需要继续深入探寻具有CRC生物学标志物潜能的miRNAs。多维度全面系统评价CRC中miRNAs的生物学功能将有助于理解CRC的发生机制,为其在预防、诊断和治疗等方面应用提供理论基础。研究目的:1.多维度筛选与结直肠癌发病风险相关的miRNAs。2.多维度鉴定与结直肠癌发病风险相关的miRNAs及其与临床病理参数的相关性。3.探讨与结直肠癌发病风险密切相关的miRNAs对结肠癌细胞系的生物学行为的影响及其作用机制。研究方法:第一部分:结直肠癌发病风险相关miRNAs多维度筛选1.公共数据库芯片筛选分析通过GEO数据库检索相关的miRNA芯片信息,并且通过GEO2R分析芯片中的结果,分别采集组织、血清、外泌体miRNA芯片信息。按照检索出的样本数量从高到低排序,选择未经放化疗等治疗的前三位芯片,通过GEO2R分析芯片中的结果并取交集,多维度分析与CRC发病风险相关的差异miRNAs。2.自备芯片筛选分析（1）收集2018年6月-2018年12月中国医科大学附属第一医院肛肠外科收治的CRC患者6例血清。患者TNM分期均为III期腺癌,包括左半结直肠癌3例,右半结肠癌3例。另收集健康非癌对照组3例,共9例血清。本研究经中国医科大学附属第一医院伦理委员会批准,每位受检者均签署知情同意书。（2）提取血清外泌体并通过电镜鉴定后,提取RNA再进行安捷伦miRNA芯片检测,分析左半结直肠癌组、右半结肠癌组、健康非癌对照组三组间的差异miRNAs。（3）芯片结果分析:去除重复与非特异的探针,以调整后的P值<0.05和|log FC|≥1且为hsa-miRNA作为筛选条件,满足筛选条件者被鉴定为在CRC中差异表达miRNAs。第二部分:结直肠癌发病风险相关miRNAs多维度鉴定1.本部分研究对象纳入2018年6月-2019年6月中国医科大学附属第一医院肛肠外科接受手术治疗的CRC患者56例,收集CRC组织及远端正常黏膜组织。同时收集了51例CRC患者及49例健康非癌人群,共100例血清。本研究经中国医科大学附属第一医院伦理委员会批准,每位受检者均签署知情同意书。2.分别提取组织、血清及外泌体RNA,反转录成c DNA,采用2-ΔCt法计算hsa-miR-1539、hsa-miR-6751-3p、hsa-miR-631、hsa-miR-4443、hsa-miR-6073、hsa-miR-1185-1-3p、hsa-miR-765、hsa-miR-150-5p、hsa-miR-6086的相对表达量,ΔCT=CT目标miRNA-CT U6,分析其与CRC发病风险的相关性。并结合患者病理资料及入院病程记录多维度分析这些目标miRNAs与临床病理参数的关系。第三部分:hsa-miR-1539对结肠癌细胞生物学行为的影响及机制研究1.本部分研究对象纳入2018年6月-2019年6月中国医科大学第一医院肛肠外科接受手术治疗的CRC患者32对肿瘤组织及配对的正常肠黏膜组织及购自中国医学科学院细胞库HCT116细胞。2.hsa-miR-1539对结肠癌细胞生物学行为的影响:构建hsa-miR-1539过表达、敲减、阴性对照质粒,提取质粒并转染HCT116细胞。采用万能显微镜判断质粒的转染效率,并通过计算hsa-miR-1539的相对表达量来评估质粒的表达效率。分别于24h、48h、72h通过CCK-8法来观测转染质粒后的细胞活性,以此来评估HCT116细胞增殖活性。此外还通过EdU法检测细胞的增殖情况。通过检测促凋亡指标Caspase3和抗凋亡指标Bcl-2的mRNA水平及流式细胞术,评估细胞凋亡情况。3.hsa-miR-1539下游靶基因筛选、验证及其潜在相关机制:通过生物信息学预测hsa-miR-1539的靶基因,并进行GO和KEGG富集分析。通过组织水平RT-qPCR实验及双荧光素酶报告实验验证hsa-miR-1539的潜在靶基因。进一步通过构建过表达、敲减及阴性对照质粒,转染HCT116细胞检测靶基因mRNA水平的表达变化,探讨hsa-miR-1539的下游靶基因及其潜在相关机制。研究结果:第一部分:结直肠癌发病风险相关miRNAs多维度筛选1.组织水平:本研究分析了目前公共数据库中研究样本数量排前三位（Top3）来自不同人群有关CRC组织与正常肠道黏膜的miRNA表达芯片信息（GSE115513、GSE18392、GSE48267）,取芯片分析结果的交集,最后得到14个差异显著的miRNAs包括hsa-miR-30a*、hsa-miR-183、hsa-miR-1、hsa-miR-552、hsa-miR-31、hsa-miR-182、hsa-miR-503、hsa-miR-139-5p、hsa-miR-551b、hsa-miR-133a、hsa-miR-137、hsa-miR-224、hsa-miR-135b、hsa-miR-378*。2.血清水平:本研究分析了目前公共数据库中研究样本数量排前三位（Top3）来自亚裔人群有关CRC患者血清及非癌人群血清的miRNA表达芯片信息（GSE106817、GSE113740、GSE124158）,取芯片分析结果的交集,最后得到915个差异显著的miRNAs。3.外泌体水平:本研究分析了公共数据库中现有的血清外泌体及细胞外泌体芯片信息（GSE39833、GSE40247）。公共数据库芯片分析结果显示CRC患者血清外泌体存在97个差异表达miRNAs,细胞外泌体找到14个差异表达miRNAs。自备芯片中,LCRC与健康非癌对照组相比,有10个表达上调miRNA及5个表达下调miRNAs,共计15个DEMs。RCRC与非癌对照组相比,有8个表达上调miRNAs及6个表达下调miRNAs,共计14个表达差异miRNAs。LCRC与RCRC对比,共3个差异miRNAs。4.结合自备外泌体芯片及GEO血清芯片结果的交互分析发现存在18个差异表达的miRNAs,即hsa-miR-1539、hsa-miR-150-5p、hsa-miR-6751-3p、hsa-miR-4443、hsa-miR-631、hsa-miR-6073、hsa-miR-1185-1-3p、hsa-miR-6086、hsa-miR-5100、hsa-miR-4463、hsa-miR-4530、hsa-miR-6756-3p、hsa-miR-3663-3p、hsa-miR-630、hsa-miR-1246、hsa-miR-4310、hsa-miR-3180-5p、hsa-miR-1296-3p。结合自备外泌体芯片及GEO外泌体芯片结果的交互分析hsa-miR-1539在CRC患者血清外泌体中表达均显著上调。而hsa-miR-150同时在GSE39833芯片预测及RCRC患者中表达存在差异。第二部分:结直肠癌发病风险相关miRNAs多维度鉴定1.组织水平:本研究提取了56对CRC肿瘤组织及配对的远端正常黏膜的组织RNA,并反转录成c DNA。基于第一部分研究的差异表达miRNAs结果,本研究挑选了9个hsa-miRNAs作为目标miRNAs,分别是hsa-miR-1539、hsa-miR-6751-3p、hsa-miR-631、hsa-miR-4443、hsa-miR-6073、hsa-miR-1185-1-3p、hsa-miR-765、hsa-miR-150-5p、hsa-miR-6086,并且通过RT-qPCR检测这9个miRNAs指标在这56对CRC肿瘤及配对的正常黏膜组织的表达水平。结果显示hsa-miR-1539（P值<0.0001）、hsa-miR-6751-3p（P值<0.0001）、hsa-miR-631（P值<0.0001）、hsa-miR-4443（P值<0.0001）、hsa-miR-6073（P值<0.001）、hsa-miR-1185-1-3p（P值=0.028）、hsa-miR-765（P值<0.001）等在CRC肿瘤组织中表达显著上调,hsa-miR-150-5p在CRC肿瘤组织中表达显著下调（P值=0.002）,而hsa-miR-6086未见明显表达差异（P值=0.186）。CRC肿瘤组织中hsa-miR-1539表达升高与Ki67指数增高显著相关（P值=0.035）。hsa-miR-150-5p表达上调与淋巴结转移（P值=0.014）及TNM分期较晚（P值=0.008）显著相关。hsa-miR-6751-3p与癌周淋巴细胞浸润程度较高存在差异趋势（P值=0.056）。hsa-miR-1185-1-3p与淋巴结转移（P值<0.001）及TNM分期较晚（P值=0.003）显著相关,并且其表达升高与周围神经侵犯（P值=0.017）及肿瘤分化程度较差（P值=0.041）显著相关。hsa-miR-4443与淋巴结转移（P值=0.004）、TNM分期较晚（P值=0.003）显著相关,并且在年龄较大组显著下调（P值=0.04）。hsa-miR-6073与Ki67指数呈正相关（P值=0.02）。hsa-miR-765与淋巴结转移（P值=0.05）及脉管癌栓（P值=0.037）显著相关。hsa-miR-6086与淋巴结转移（P值=0.004）及TNM分期（P值=0.011）相关。2.血清水平:本研究提取了51例CRC患者及49例健康对照人群血清RNA,并反转录成c DNA。并且通过RT-qPCR法检测hsa-miR-1539、hsa-miR-150-5p及hsa-miR-6751-3p相对表达水平与CRC发病风险的相关性。hsa-miR-1539、hsa-miR-6751-3p与CRC发病风险无明显差异（P值分别为0.104和0.617）,而hsa-miR-150-5p存在表达水平下调趋势（P值=0.079）。此外,通过亚组分析发现血清hsa-miR-1539在左半结直肠癌中表达显著下降（P值=0.031）,血清hsa-miR-150-5p在右半结肠癌中表达显著下降（P值=0.010）。肿瘤发病位置不同,hsa-miR-1539表达水平不同（P值=0.047）,hsa-miR-150-5p存在表达差异趋势（P值=0.064）。VEGF高表达与hsa-miR-1539（P值=0.028）及hsa-miR-6751-3p（P值=0.002）表达水平明显升高有关,而与hsa-miR-150-5p表达水平显著下降（P值=0.018）相关。hsa-miR-150-5p表达下调还与EGFR高表达相关（P值=0.042）。hsa-miR-6751-3p高表达与肿瘤细胞分化较差相关（P值=0.016）。3.外泌体水平:通过试剂盒法提取血清外泌体后,本研究运用透射电镜、纳米颗粒示踪分析及Western blot这三种常用方法进行外泌体鉴定。证明此方法成功后,本研究提取了51例CRC患者及49例健康对照人群共100例血清外泌体RNA,并反转录成c DNA。通过RT-qPCR法鉴定hsa-miR-1539、hsa-miR-150-5p、hsa-miR-6751-3p与CRC发病风险的关系。hsa-miR-1539在CRC患者中表达显著升高（P值=0.003）,hsa-miR-150-5p表达呈下降趋势（P值=0.063）,hsa-miR-6751-3p无差异（P值=0.644）。hsa-miR-1539、hsa-miR-150-5p及hsa-miR-6751-3p整体表达水平与临床病理参数未见显著差异,但是在分化程度较差组,hsa-miR-150-5p表达呈下降趋势（P值=0.068）。第三部分:hsa-miR-1539对结肠癌细胞生物学行为的影响及机制研究1.hsa-miR-1539对结肠癌细胞生物学行为的影响细胞增殖活性:构建hsa-miR-1539过表达、敲减、阴性对照质粒并转染HCT116细胞24h后,检测转染效率高于50%。而过表达效率是阴性对照的75.1倍（P<0.01）,敲减效率是阴性对照的52.9%（P值<0.01）。通过CCK-8法检测三组不同质粒转染后的HCT116细胞在24h、48h、72h的细胞活性,结果显示在48h时敲减组与阴性对照组OD值显著减低（P值<0.05）,72h三组间OD值具有显著差异（P值<0.01）,其中过表达组OD值显著升高（P值<0.05）,敲减组显著降低（P值<0.01）。通过EdU法检测三组不同质粒转染后的HCT116细胞增殖情况,结果显示过表达hsa-miR-1539组EdU阳性细胞比率增高（P值<0.01）,敲减hsa-miR-1539组EdU阳性细胞比率降低（P值<0.01）。细胞凋亡效应:构建hsa-miR-1539过表达、敲减、阴性对照质粒并转染HCT116细胞24h后,在过表达组、敲减组、阴性对照组检测促凋亡指标Caspase 3及抗凋亡指标Bcl-2的mRNA水平存在显著差异（P值<0.05）。Caspase 3表达水平在过表达组为0.597±0.201,敲减组为1.522±0.233。而Bcl-2表达水平在过表达组为1.557±0.557,敲减组为0.779±0.058。通过流式细胞学法检测三组不同质粒转染后的HCT116细胞凋亡情况,结果显示过表达hsa-miR-1539组早期凋亡细胞比例降低（P值<0.01）,敲减hsa-miR-1539组晚期凋亡比例增高（P值<0.01）。2.hsa-miR-1539下游靶基因筛选、验证及其功能分析通过miRWalk及Target Scan数据库分别预测hsa-miR-1539的潜在靶基因,取这两个数据库的交集,共有155个基因作为候选靶基因。GO基因功能富集分析结果显示大多数靶基因在转录、发育生长、细胞增殖等生物学过程中富集,同时也在RNA聚合酶II转录因子活性、生长因子活性等分子功能中富集。通过KEGG通路富集分析发现hsa-miR-1539的靶基因可能参与了PI3K-Akt、MAPK、Ras、Rap-1、AMPK、Jak-STAT、HIF、p53等多种癌症信号通路。3.hsa-miR-1539下游靶基因RT-qPCR及双荧光素酶实验验证通过组织水平RT-qPCR验证靶基因,结果显示GJA4（P值=0.003）、ARFGAP（P值<0.001）、ZHX3（P值=0.008）、FLT1（P值=0.004）在CRC组织中高表达,而GPIHBP1（P值<0.001）和IGF1（P值<0.001）在CRC组织中低表达,NFIA、MMP19和TNFRSF14无统计学差异（P值分别为0.29,0.866,0.224）。双荧光素酶实验报告结果提示hsa-miR-1539载体质粒+3’UTR阴性对照组质粒与hsa-miR-1539载体质粒+3’UTR IGF1野生型质粒组相比,其luciferase的表达量差异>20%（P值<0.001）,hsa-miR-1539载体质粒+3’UTR IGF1野生型质粒组与hsa-miR-1539载体质粒+3’UTR IGF1突变体质粒组相比,其luciferase的表达量差异>20%（P值<0.001）。因此,hsa-miR-1539能与IGF1的3’UTR区域结合,抑制其荧光酶活性。hsa-miR-1539载体质粒+3’UTR阴性对照组质粒与hsa-miR-1539载体质粒+3’UTR GPIHBP1野生型质粒组相比,其luciferase的表达量差异<20%。hsa-miR-1539载体质粒+3’UTR GPIHBP1野生型质粒组与hsa-miR-1539载体质粒+3’UTR GPIHBP1突变体质粒组相比,其luciferase的表达量差异<20%。hsa-miR-1539不能与GPIHBP1的3’UTR结合,抑制其荧光酶活性。4.hsa-miR-1539过表达及敲减对其下游靶基因IGF-1表达的影响在HCT116细胞系中过表达hsa-miR-1539后,与阴性对照组相比,IGF-1表达水平显著降低,（0.59±0.17,P值<0.05）,而敲减hsa-miR-1539后,IGF-1表达水平显著升高（2.04±0.35,P值<0.05）。结论:1.本研究从组织、血清及外泌体等不同维度筛选鉴定出一组新的与结直肠癌发病风险相关的miRNAs。其中,外泌体hsa-miR-1539在诊断效能方面具有较高敏感性;血清hsa-miR-1539能预警左半结直肠癌风险并具有较高特异性;血清hsa-miR-150-5p能预警右半结肠癌风险。多个组织miRNAs（hsa-miR-1539、hsa-miR-6751-3p、hsa-miR-631、hsa-miR-4443、hsa-miR-6073、hsa-miR-1185-1-3p、hsa-miR-765、hsa-miR-150-5p）与结直肠癌发病风险及临床病理参数相关。2.hsa-miR-1539可以促进CRC细胞增殖、抑制细胞凋亡。hsa-miR-1539可能通过调控其靶基因IGF-1发挥生物学作用。