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C/EBPβ3UTR RNA具有肿瘤抑制作用，当其在肿瘤细胞如肝癌细胞内过表达时，导致细胞生长受到明显抑制、软琼脂克隆形成率和裸鼠成瘤率降低及部分恶性细胞表型回复突变.当C/EBPβ3UTR两端发生缺失后，尤其是3末端（A/U富集区），C/EBPβ3UTR的肿瘤抑制作用明显受到抑制，这一结果提示这段A/U富集序列在C/EBPβ3UTR RNA发挥其肿瘤抑制中起着重要作用.为研究当这段A/U富集序列单独存在时在肿瘤抑制中发挥的作用及其分子机制，利用缺失突变的方法构建了仅含A/U富集序列的克隆载体pSP64-62.以线形化pSP64-62载体为模板，用SP6 RNA polymerase在体外转录和纯化这段A/U富集RNA，长度为62核苷酸，命名为R62.将R62作为单独存在的短RNA，通过一过性脂质体转染导入肝癌细胞系SMMC-7721中.结果显示当R62导入肝癌细胞SMMC-7721后，其细胞生长速率显著受到抑制，细胞周期被阻滞在G2/M期并伴随有细胞凋亡增加，细胞内Caspase3蛋白高度表达.另外，与细胞存活、生长和周期进程有关的蛋白如C/EBPβ、ERK1/2、IGF-IR和bcl-2的表达也受到显著抑制.由于R62是非编码RNA，推测R62可能是通过与细胞内某些蛋白结合发挥其肿瘤抑制作用的.为证实这一假设，首先需要鉴定细胞内与R62专一结合的蛋白种类.利用EDC和NHS介导的缩合反应将R625末端磷酸基化学偶联到氨基磁珠Amine M-270上的伯氨基上，通过生成氨基磷酸酯键将R62固定在磁珠上，即R62-M270.通过R62-M270与肝癌细胞SMMC-7721的抽提物进行RNA亲和层析，分离和纯化R62结合蛋白，经质谱分析和western blotting验证发现R62能够与两种RNA结合蛋白hnRNPC和HuR结合，且R62对HuR具有结合特异性.荧光分子杂交和共聚焦显微镜观察发现R62在细胞内与HuR共定位，其大部分分布于细胞核内.siRNA-HuR和R62一过性转染结果显示C/EBPβ、ERK1/2和bcl-2 mRNA表达水平没有下降，提示R62并非通过抑制这些mRNA表达水平来抑制蛋白表达的;R62添加的免疫共沉淀结果显示R62能够显著抑制HuR与这三个mRNAs结合.因此，推测R62是通过竞争性结合HuR抑制这些蛋白表达，从而抑制肝癌细胞的生长和增殖.此外，R62一过性转染能够诱导截短的PKCε表达，促进CK18磷酸化，使细胞周期阻滞在G2/M期.以上结果证明R62在C/EBPβ3UTR发挥肿瘤抑制作用起着重要的作用，而其作用途径可能是多样的.为探讨R62结合蛋白HuR和hnRNPC在肝癌细胞中的作用，首先构建了真核表达载体pEGFP-HuR和pEGFP-hnRNPC2，并在SMMC-7721细胞中稳定表达GFP-HuR和GFP-hnRNPC2.实验结果显示，过表达HuR和hnRNPC2的肝癌细胞其细胞生长速率加快，多核细胞数所占比例上升.进一步实验发现过表达的HuR和hnRNPC2能够显著抑制Aurora B和RhoA表达.当用RNA干扰的方法抑制内源Aurora B和RhoA蛋白表达后，肝癌细胞SMMC-7721中的多核细胞数量明显上升，证明肝癌中多核细胞的形成受这两种蛋白的控制.qPCR分析显示，在过表达HuR和hnRNPC2的SMMC-7721细胞中，Aurora B和RhoA mRNAs表达水平或者其稳定性增加.mRNA-eIF4E免疫共沉淀和HuR-eIF4E免疫共沉淀结果显示HuR和hnRNPC2能够与mRNA帽子结合蛋白，即翻译起始因子eIF4E结合，抑制eIF4E与Aurora B和RhoA mRNAs结合.当eIF4E在过表达HuR的SMMC-7721细胞中高表达时，Aurora B和RhoA蛋白表达增加.这些结果表明HuR和hnRNPC2可能通过与eIF4E结合，抑制AuroraB和RhoA mRNAs的翻译，引起肝癌细胞多核化.