一、大鼠骨髓间充质干细胞体外培养及其生物学特性的实验研究。目的:建立一种简单,快速的分离、纯化大鼠骨髓间充质干细胞并适宜其在体外大量快速增殖的方法;进一步了解骨髓间充质干细胞的各种生物学特性。方法: 1无菌条件下取大鼠双侧股骨、胫骨和胸骨,并用吸取D-Hank’s液的注射器冲出骨髓细胞,置于含10%FBS、100U/ml双抗的L-DMEM培养基中,37℃、5%CO2环境下进行培养,应用全骨髓培养法结合贴壁分离的方法进行纯化。待细胞达95%融合时,用0.125%的胰酶-0.02%的EDTA消化2-3min后进行传代。倒置显微镜下观察原代及传代后的细胞生长特点。2扫描电镜(SEM)下观察大鼠骨髓间充质干细胞表面的超微结构特征。3 HE染色光镜观察大鼠骨髓间充质干细胞的形态特征。4用MTT法测定大鼠骨髓间充质干细胞的生长曲线,从而进一步了解其生长特性。结果:原代培养的骨髓细胞成分复杂,1-2天开始有少量细胞贴壁,形状不规则,有长梭形、多角形等。半量换液后,克隆生长的细胞团块开始迅速增殖,以集落形式生长为主。7-9天左右细胞可长满培养瓶底,达95%以上融合,主要呈纺锤形,其中散在少量折光性强的小圆形细胞。细胞整体排列更趋于规律性,呈漩涡状,辐射状或鱼群样排列。传代后的细胞贴壁及生长更加迅速,2h后部分细胞即开始贴壁,24h内即可完全贴壁,6-7天可铺满培养瓶底。细胞形态更均一,纺锤形生长,整体呈现漩涡状,辐射状或鱼群样排列。传代10代以上,各代之间细胞生长均一,稳定。HE染色示胞体以纺锤形居多,有突起。细胞核大、居中深染,嗜碱性,核仁明显;胞质着色浅,呈弱嗜酸性。P2、P4、P6细胞生长曲线基本相同,分为潜伏期(第1-2天)、对数生长期(第3-5天)和平台期(第6-7天),且几代细胞间生长状况稳定。扫描电镜下可见到三种形态的细胞:以宽大扁平形的细胞为主,长梭形和圆球形细胞占少数。胞体周围的突起类似树枝状,并互相重叠,相互交织。细胞核大,圆形或椭圆形,核仁1-5个不等。表面可见大量短而粗的微绒毛样突起。结论:1本部分应用全骨髓培养法结合贴壁分离法成功建立了一种体外简单、快速的分离、纯化大鼠骨髓间充质干细胞的方法,并使其在体外迅速得到了增殖,而且性状稳定。2细胞呈均一的纺锤形;P2、P4、P6细胞生长曲线基本相同,细胞增殖快,且几代细胞间生长状况稳定。3扫描电镜下可见到三种形态的细胞:以宽大扁平形的细胞为主,长梭形和圆球形细胞占少数。细胞表面可见大量短而粗的微绒毛样突起,推测这样的结构特征可能更有利于细胞内外的物质交换。二、大鼠骨髓间充质干细胞体外向神经元诱导分化的实验研究目的:体外定向诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经元分化。方法:1按照第一部分的方法收集大鼠骨髓间充质干细胞,分离、纯化、培养、传代。2分别取不同代数对数生长期的细胞,应用二甲基亚砜(DMSO)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对其进行不同方式的诱导。应用免疫细胞化学染色及western blot的方法鉴定诱导后的细胞神经元特异性烯醇化酶(NSE)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和神经微管相关蛋白-2(MAP-2)的表达。结果:对照组:细胞在预诱导和正式诱导过程中细胞形态均无明显变化,免疫细胞化学结果显示NSE为阴性表达。实验组:细胞在24h的预诱导中形态无明显变化,正式诱导后1h细胞胞体开始向胞核收缩,呈圆形;3h后胞体圆形呈典型的核质体形态,并开始长出1-3个细胞突起;5h后突起不断延长,出现2-3级突起并相互交错;7h后胞体圆形,伸出的2-3级突起相互交织成网状。其中含血清诱导组中细胞诱导5h开始有部分细胞漂浮死亡现象,而无血清诱导组则无此现象。免疫细胞化学结果显示:未行预诱导的两组中,培养基中有血清组与无血清组的诱导率分别为:71.857±7.08249%、72.597±6.98511%。应用1%DMSO+10ng/ml bFGF+无血清L-DMEM预诱导24h,10ng/mlbFGF+10%DMSO+无血清L-DMEM正式诱导7 h的细胞NSE的表达率为86.67±5.5148%。GFAP和MAP-2在各时间点均表达阴性。western blot结果显示诱导后细胞NSE在0h、3h、5h、7h的表达(与β-actin的比值)分别为0.232±0.00364、0.3141±0.00414、0.321±0.00186、0.4683±0.00447。结论:1应用1%DMSO+10ng/ml bFGF+无血清L-DMEM预诱导24h,10ng/mlbFGF+10%DMSO+无血清L-DMEM正式诱导7h可以诱导MSC分化成为神经元样细胞,并达到最大的诱导率86.67%。2应用1%DMSO+10ng/ml bFGF+无血清L-DMEM预诱导24h,可显著提高MSC向神经元样细胞的诱导率。3诱导液中无血清可延长诱导后细胞的生存时间。三、BrdU体外标记大鼠骨髓间充质干细胞的实验研究。目的:探讨连续培养的骨髓间充质干细胞应用BrdU标记的稳定性、最佳阶段、时间和剂量,从而达到应用骨髓间充质干细胞进行研究最好的示踪目的。方法:1按照第一部分的方法收集大鼠骨髓间充质干细胞,分离、纯化、培养、传代。2取不同代数的细胞进行细胞爬片,在细胞生长的不同时期、应用不同浓度的BrdU标记不同时间后,用免疫细胞化学染色的方法进行鉴定。结果:1对P2、P4、P6的MSC进行BrdU标记,其标记率分别为94.868±3.739%、95.696±3.952%、94.774±3.565%。2对生长至第2、4、6天的细胞进行标记,标记率分别为60.286±6.197%、96.175±3.689%、65.017±5.982%。3对细胞标记24h、48h、72h时,标记率分别为58.895±10.025%、95.375±4.136%、94.835±2.970%。4分别应用BrdU浓度为5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L标记时,标记率分别为47.192±5.459%、95.382±4.363%、95.993±3.344%。结论:1应用BrdU对不同代MSC进行标记效果稳定。2选择浓度为10μmol/L,对处于对数生长期的MSC标记48h,可以达到最大的标记率。