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羊绒制成的纺织品轻薄柔软，保温效果极佳，加之羊绒产量较少，所以具有极高的经济价值。内蒙古绒山羊阿尔巴斯型主要分布于内蒙古西北部地区，该品种繁殖率高，体型较大，所产羊绒纤维纤细，能够满足高端纺织品对原材料的各项要求。但因羊绒具有细而短的特点，纤维间的抱合力和摩擦力均小，易产生起球现象，增加羊绒纤维的长度能够有效解决这一问题。血管内皮细胞生长因子(Vascular Endothelial Growth Factor,VEGF)能够通过诱导血管形成而促进绒毛生长，成纤维细胞生长因子5(Fibroblast Growth Factor5,FGF5)可以通过调节毛囊生长周期而影响羊绒纤维长度，二者对毛发生长分别具有正向和负向调控的作用，本研究以VEGF在FGF5位点定点整合绒山羊为动物模型，研究基因编辑对绒山羊表型的影响，并通过多种高通量测序技术结合分子生物学手段来探究VEGF和FGF5调节绒山羊毛发生长的作用机制，发掘下游功能基因和核心作用分子，同时为高产优质绒山羊新品种的培育提供理论依据。
一、VEGF在FGF5位点定点整合基因编辑绒山羊的鉴定及检测
1、基因编辑绒山羊基因整合情况鉴定
首先通过PCR和Southern Blot在DNA水平对VEGF在FGF5位点定点整合基因编辑绒山羊的基因整合情况进行鉴定，结果出现序列和长度正确的特异性条带，证明VEGF在FGF5位点实现整合；通过real-time PCR检测基因表达量，该基因编辑绒山羊皮肤组织中VEGF和FGF5分别是对照组的1.63倍和0.41倍，结果与Western Blot一致，表明VEGF在高表达的同时降低了FGF5的表达量；此外，从脱靶分析和健康状况方面对基因编辑绒山羊的安全性进行检测，结果表明该基因编辑绒山羊没有发生脱靶且健康状况良好。
2、基因编辑绒山羊产绒性能检测
从宏观和微观两方面对基因编辑绒山羊的产绒性能进行检测。宏观方面，该绒山羊表现出了多部位羊绒成簇聚集生长的表型，与对照相比产绒量提高31.5%，绒纤维长度增加35%，且并没有影响绒纤维的细度和强度；微观方面，通过石蜡切片及HE染色发现该绒山羊皮肤组织中次级毛囊的数量与对照相比增加19%，次级毛囊平均直径增加48.3%。表明该绒山羊具有良好的产绒性能，可以作为动物模型用于研究VEGF和FGF5调节绒山羊绒毛生长的作用机制，并可作为高产优质绒山羊培育的育种材料。
二、VEGF在FGF5位点定点整合基因编辑绒山羊的多组学分析
1、转录组学研究
以基因编辑绒山羊为实验组，以未经基因编辑的体细胞核移植绒山羊和经自然交配产生的野生型绒山羊共同作为对照组，通过转录组测序研究皮肤组织在mRNA水平的差异。按照|log2FC|≥0.848、p-adjust＜0.05为标准，共筛选到差异基因1,246个，其中上调基因843个，下调基因403个。对差异基因参与的生物学功能进行分析，发现其主要富集到生长因子结合、PI3K-AKT信号通路和细胞外基质(Extracellular Matrix,ECM)受体互作中，且PI3K-AKT信号通路与VEGF信号通路有交汇，共同作用于花生四烯酸代谢。
2、TMT(Tandem Mass Tags)蛋白质组学研究
通过TMT标记，对绒山羊皮肤组织中的蛋白质进行研究，以上调差异倍数1.2、下调差异倍数0.83、p-adjust＜0.05为标准，共筛选得到差异蛋白178个，其中上调蛋白108个，下调蛋白70个。在GO富集中，差异蛋白主要富集到花生四烯酸代谢过程、内质网腔和铁离子结合；在KEGG富集中，差异蛋白主要富集在其他多糖降解、类固醇生物合成、花生四烯酸代谢。且差异蛋白在花生四烯酸代谢中的富集呈现出高表达蛋白多而分散、低表达蛋白少而集中的特点。
3、LC-MS非靶向代谢组学研究
通过非靶向代谢组学分析绒山羊皮肤组织中代谢物的种类和含量，共筛选到122个已被命名的差异代谢物，其中阳离子73个，阴离子49个。在KEGG富集中，差异代谢物主要富集到亚油酸代谢、花生四烯酸代谢和甲状腺素合成中，且代谢物在花生四烯酸代谢中富集的位置与蛋白质组一致。
此前研究表明，VEGF表达量的升高和FGF5的降低均能提高p-AKT的表达，证明PI3K-AKT信号通路被激活。结合本研究中高通量测序结果，表明VEGF的高表达与FGF5的敲除共同激活PI3K-AKT信号通路，进而影响花生四烯酸的代谢进程，最终对绒山羊的绒毛生长产生影响。
三、VEGF和FGF5调节绒山羊绒毛生长的研究
以GFFs为实验材料，通过添加PI3K-AKT信号通路激活剂740Y-P和抑制剂NU7441，分析二者对GFFs细胞增殖、凋亡和周期方面的影响，并通过real-time PCR和Western Blot对PI3K-AKT信号通路中的核心蛋白AKT及其磷酸化形式p-AKT和花生四烯酸代谢通路中的PLA2G4D、PTGS2、CYP2B和EPHX2的表达量进行检测，探究VEGF和FGF5对花生四烯酸代谢通路的影响。结果显示在PI3K-AKT信号通路激活剂740Y-P处理后的GFFs中，上述基因的表达趋势与VEGF在FGF5位点定点整合基因编辑绒山羊皮肤组织中的趋势一致。表明VEGF和FGF5通过影响PI3K-AKT信号通路的活化状态，进而作用于花生四烯酸代谢，阻碍了花生四烯酸向EETs(Epoxyeicosa trienoic acid)和DHETs(Dihydroxyeicosa trienoic acid)的转化，进而促进绒山羊的绒毛生长。
本研究初步阐明了VEGF和FGF5调节绒山羊毛发生长的机制，为培育高产优质绒山羊提供了育种材料，更为下游功能基因和核心作用分子的发掘提供了理论基础。
一、VEGF在FGF5位点定点整合基因编辑绒山羊的鉴定及检测
1、基因编辑绒山羊基因整合情况鉴定
首先通过PCR和Southern Blot在DNA水平对VEGF在FGF5位点定点整合基因编辑绒山羊的基因整合情况进行鉴定，结果出现序列和长度正确的特异性条带，证明VEGF在FGF5位点实现整合；通过real-time PCR检测基因表达量，该基因编辑绒山羊皮肤组织中VEGF和FGF5分别是对照组的1.63倍和0.41倍，结果与Western Blot一致，表明VEGF在高表达的同时降低了FGF5的表达量；此外，从脱靶分析和健康状况方面对基因编辑绒山羊的安全性进行检测，结果表明该基因编辑绒山羊没有发生脱靶且健康状况良好。
2、基因编辑绒山羊产绒性能检测
从宏观和微观两方面对基因编辑绒山羊的产绒性能进行检测。宏观方面，该绒山羊表现出了多部位羊绒成簇聚集生长的表型，与对照相比产绒量提高31.5%，绒纤维长度增加35%，且并没有影响绒纤维的细度和强度；微观方面，通过石蜡切片及HE染色发现该绒山羊皮肤组织中次级毛囊的数量与对照相比增加19%，次级毛囊平均直径增加48.3%。表明该绒山羊具有良好的产绒性能，可以作为动物模型用于研究VEGF和FGF5调节绒山羊绒毛生长的作用机制，并可作为高产优质绒山羊培育的育种材料。
二、VEGF在FGF5位点定点整合基因编辑绒山羊的多组学分析
1、转录组学研究
以基因编辑绒山羊为实验组，以未经基因编辑的体细胞核移植绒山羊和经自然交配产生的野生型绒山羊共同作为对照组，通过转录组测序研究皮肤组织在mRNA水平的差异。按照|log2FC|≥0.848、p-adjust＜0.05为标准，共筛选到差异基因1,246个，其中上调基因843个，下调基因403个。对差异基因参与的生物学功能进行分析，发现其主要富集到生长因子结合、PI3K-AKT信号通路和细胞外基质(Extracellular Matrix,ECM)受体互作中，且PI3K-AKT信号通路与VEGF信号通路有交汇，共同作用于花生四烯酸代谢。
2、TMT(Tandem Mass Tags)蛋白质组学研究
通过TMT标记，对绒山羊皮肤组织中的蛋白质进行研究，以上调差异倍数1.2、下调差异倍数0.83、p-adjust＜0.05为标准，共筛选得到差异蛋白178个，其中上调蛋白108个，下调蛋白70个。在GO富集中，差异蛋白主要富集到花生四烯酸代谢过程、内质网腔和铁离子结合；在KEGG富集中，差异蛋白主要富集在其他多糖降解、类固醇生物合成、花生四烯酸代谢。且差异蛋白在花生四烯酸代谢中的富集呈现出高表达蛋白多而分散、低表达蛋白少而集中的特点。
3、LC-MS非靶向代谢组学研究
通过非靶向代谢组学分析绒山羊皮肤组织中代谢物的种类和含量，共筛选到122个已被命名的差异代谢物，其中阳离子73个，阴离子49个。在KEGG富集中，差异代谢物主要富集到亚油酸代谢、花生四烯酸代谢和甲状腺素合成中，且代谢物在花生四烯酸代谢中富集的位置与蛋白质组一致。
此前研究表明，VEGF表达量的升高和FGF5的降低均能提高p-AKT的表达，证明PI3K-AKT信号通路被激活。结合本研究中高通量测序结果，表明VEGF的高表达与FGF5的敲除共同激活PI3K-AKT信号通路，进而影响花生四烯酸的代谢进程，最终对绒山羊的绒毛生长产生影响。
三、VEGF和FGF5调节绒山羊绒毛生长的研究
以GFFs为实验材料，通过添加PI3K-AKT信号通路激活剂740Y-P和抑制剂NU7441，分析二者对GFFs细胞增殖、凋亡和周期方面的影响，并通过real-time PCR和Western Blot对PI3K-AKT信号通路中的核心蛋白AKT及其磷酸化形式p-AKT和花生四烯酸代谢通路中的PLA2G4D、PTGS2、CYP2B和EPHX2的表达量进行检测，探究VEGF和FGF5对花生四烯酸代谢通路的影响。结果显示在PI3K-AKT信号通路激活剂740Y-P处理后的GFFs中，上述基因的表达趋势与VEGF在FGF5位点定点整合基因编辑绒山羊皮肤组织中的趋势一致。表明VEGF和FGF5通过影响PI3K-AKT信号通路的活化状态，进而作用于花生四烯酸代谢，阻碍了花生四烯酸向EETs(Epoxyeicosa trienoic acid)和DHETs(Dihydroxyeicosa trienoic acid)的转化，进而促进绒山羊的绒毛生长。
本研究初步阐明了VEGF和FGF5调节绒山羊毛发生长的机制，为培育高产优质绒山羊提供了育种材料，更为下游功能基因和核心作用分子的发掘提供了理论基础。