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目的:以miRNA/MAPK作用环路为切入点探讨清络通痹方不同功效组分干预类风湿关节炎的作用机制。方法:1、RA患者外周血和关节炎大鼠破骨细胞miRNAs异常表达谱比较及特征性miRNAs功能分析:佐剂关节炎大鼠造模,提取分离滑膜成纤维细胞和单核细胞,利用悬挂式培养小室和六孔板将上述两种细胞进行共培养,成纤维细胞置于上层小室内,单核细胞置于下层六孔板内,诱生破骨样细胞。分别提取外周血单核细胞,破骨样细胞总RNA,阴虚络热证RA患者与健康志愿者血液RNA,采用miRNAs芯片,筛选RA患者与正常人外周血、大鼠破骨细胞与正常基质细胞的miRNAs表达谱的差异;Real time PCR对芯片结果进行验证;生物信息学方法对关键miRNAs进行功能分析。2、miR-143-3p对破骨细胞分化前后期MAPK信号通路相关蛋白表达的影响:FAM-siRNA瞬时转染分化前期和分化后期的破骨细胞,倒置荧光显微镜下观察荧光现象,筛选最佳转染条件;Real-time PCR检测转染后细胞中miR-143-3p的表达,筛选、确定转染miR-143-3p的细胞模型;将细胞分为3组,即空白对照组、miR-143-3p转染组、miR-143-3p转染对照组,Western blot检测各组 MAPK 相关蛋白 P38、P-P38、ERK、P-ERK、JNK、P-JNK 的表达量。3、MAPK抑制剂对破骨细胞分化前后期miR-143-3p表达的影响:将破骨细胞分别培养至5-7天和12-14天时,分为4组,为空白组、JNK抑制剂组、P38抑制剂组和ERK抑制剂组,设置一定数量复孔。除空白组外,其余每组细胞分别给予10umol/L的JNK抑制剂、P38抑制剂和ERK抑制剂,4h后提取总RNA,运用PCR技术检测各组miR-143-3p的表达量;4、基于miR-143-3p/MAPK探讨清络通痹方不同功效组分干预类风湿关节炎的作用机制:滑膜成纤维细胞-外周血单核细胞共培养至第5-7天时,分为12组(分别为空白组、miR-143-3p mimics NC、miR-143-3p mimics、miR-143-3p mimics NC+TP、miR-143-3p mimics NC+PNS、miR-143-3p mimics NC+CAT、miR-143-3p mimics+TP、miR-143-3p mimics+PNS、miR-143-3p mimics+CAT、TP、PNS、CAT 组),miR-143-3p mimics 和miR-143-3p mimics NC加药组分别转染相应基因后48h加入TP,PNS,CAT 20ug/ml,48h后提取相应蛋白。结果:1、RA患者外周血和关节炎大鼠破骨细胞miRNAs异常表达谱比较及特征性miRNAs功能分析结果:与正常人相比,RA患者外周血中具有差异表达的miRNAs有189个;与单核细胞比较,破骨细胞中具有差异表达的miRNAs有211个,其中miR-143-3p等11个miRNAs在RA患者外周血及大鼠破骨细胞中均异常表达。Real time PCR验证结果与芯片检测结果具有一致性。生物信息学分析结果显示特征性miRNAs的靶基因显著富集在T细胞受体、MAPK信号通路等信号通路中。2、miR-143-3p对破骨细胞分化前后期MAPK信号通路相关蛋白表达的影响:破骨细胞分化前期,过表达miR-143-3p后能显著抑制ERK1/2和P-ERK1/2蛋白的表达,而抑制miR-143-3p后,ERK1/2和P-ERK1/2蛋白表达升高;破骨细胞分化后期,过表达miR-143-3p后能显著抑制JNK/P-JNK蛋白的表达,抑制miR-143-3p后,JNK和P-JNK蛋白表达升高。3、MAPK抑制剂对破骨细胞分化前后期miR-143-3p表达的影响:破骨细胞分化前期,加入ERK1/2抑制剂后能显著促进miR-143-3p的表达;破骨细胞分化后期,加入JNK抑制剂后能显著促进miR-143-3p的表达。4、基于miR-143-3p/MAPK探讨清络通痹方不同功效组分干预类风湿关节炎的作用机制:将破骨细胞培养至5-7天后,分为12组(空白对照组、miR-143-3p mimics NC、miR-143-3p mimics、miR-143-3p mimics NC+TP、miR-143-3p mimics NC+PNS、miR-143-3p mimics NC+CAT、miR-143-3p mimics+TP、miR-143-3p mimics+PNS、miR-143-3p mimics+CAT、TP、PNS、CAT组),与空白组相比,在破骨细胞中直接加入TP、PNS、CAT后,均能不同程度抑制MAPK相关蛋白的表达,以TP最为显著。结论:通过RA患者外周血和关节炎大鼠破骨细胞miRNAs芯片比较,发现了在两者中均异常表达的miRNAs,而结合课题组前期对类风湿关节炎小鼠miRNAs芯片分析结果,发现miR-143-3p在RA病人、类风湿关节炎大小鼠中表达均显著下降,提示miR-143-3p可能在类风湿关节炎的发生发展中起重要作用。而破骨细胞分化前期,miR-143-3p能调控ERK1/2和P-ERK1/2蛋白的表达;破骨细胞分化后期,miR-143-3p能调控JNK和P-JNK蛋白的表达,反之,MAPK抑制剂能促进miR-143-3p的表达,提示在破骨细胞分化前后期miR-143-3p与MAPK信号通路之间能形成相互作用的环路,共同调控破骨细胞的分化从而参与类风湿关节炎的发生发展,而环路中的任一部分受到影响即会影响破骨细胞分化从而影响类风湿关节炎。破骨细胞分化5-7天时加入TP、PNS和CAT后,发现均能不同程度的抑制MAPK相关蛋白的表达,以TP最为明显,而通过检测miR-143-3p的含量,发现TP能促进miR-143-3p的表达,而PNS、CAT作用不显著,提示TP可能够通过调节机制上游的miR-143-3p进一步干预ERK1/2影响MAPK信号通路;或者通过直接抑制MAPK相关蛋白的表达来影响miR-143-3p从而参与调节类风湿关节炎。PNS、CAT则通过直接抑制MAPK相关蛋白的表达抑制MAPK信号通路的活性参与调节类风湿关节炎。即清络通痹方不同功效组分可能通过作用于miR-143-3p/MAPK环路不同靶位而产生协同作用。