原发性肝癌(以下简称肝癌)是世界第六位常见的恶性肿瘤。根据GLOBOCAN 2002年统计结果，全世界每年的肝癌新发例数为62.6万，其中我国就占55％(约34.4万)，其发病率和死亡率均居我国各种恶性肿瘤的第二位。 作为恶性肿瘤治疗领域热点之一的分子靶向治疗，也为肝癌的治疗提供了新的思路和希望。目前国内外对这一领域的研究热潮方兴未艾，对各种细胞表面分子与肿瘤发生发展关系的研究不断深入，针对不同分子靶点的新型靶向药物不断涌现。其中研究者们对表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)的研究开展较早且深入，针对EGFR的靶向药物被陆续开发出来，但国外学者对其应用和研究多集中于非小细胞肺癌、乳腺癌、结直肠癌等癌种，对肝癌的治疗研究不多。 EGFR是原癌基因cerbB1(HER1)的表达产物，分子质量为170kDa，是一种具有酪氨酸蛋白激酶(tyrosine protein kinase，TPK)活性的细胞膜表面糖蛋白受体。目前研究认为与EGFR信号转导有关的途径最主要有两条：一条是Ras/Raf/MAPK(ERK)途径，该途径主要与细胞的增殖、存活和转化有关；另一条是PI3-K/AKT途径，该途径主要与细胞增殖、凋亡、运动等一系列生理功能有关。 目前靶向EGFR治疗恶性肿瘤丰要有两类药物，一种是针对EGFR胞外部分的单克隆抗体，代表药物为西妥昔单抗(cetuximab)，cetuximab是一种人鼠嵌合抗EGFR的单克隆抗体，与EGFR有很强的亲和力，能竞争性抑制EGFR与其配体EGF和TGF-a等的结合，从而阻断EGFR的激活和其下游信号转导通路的活化，并通过诱导EGFR的内吞、失活，下调其在胞膜的表达水平，还可激活抗体依赖的细胞毒作用(ADCC)，产生进一步的细胞杀伤效应；另一种是针对EGFR胞内部分的小分子酪氨酸蛋白激酶抑制剂，代表药物为厄洛替尼(erlotinib)等，其作用机制为：与ATP竞争EGFR胞内部分TPK结构域上的结合位点，阻断EGFR的自身磷酸化，从而阻断由EGFR活化引起的一系列胞内级联酶促反应，阻止活化信号传导至核内，使细胞周期停滞，并诱导细胞发生凋亡。 本论文的目的在于通过检测肝癌患者肿瘤组织和癌旁肝组织中EGFR及其下游信号转导通路中关键蛋白的表达，分析它们与肝癌患者生存预后的关系；观察cetuximab联合erlotinib对人肝癌细胞系HepG2和Bel-7402的体外增殖抑制作用，探讨两药之间是否具有协同效应；应用流式细胞仪检测两药联合诱导HepG2和Bel-7402细胞凋亡的作用，并应用免疫蛋白印迹(Western Blot)法检测了凋亡关键蛋白表达的变化；WB法检测两药联合对HepG2和Bel-7402细胞EGFR信号转导通路关键蛋白表达的影响，探讨其协同作用的分子机制；按照不同序贯的给药方案，将cetuximab和erlotinib分别与化疗药物联合作用于HepG2和Bel-7402细胞，观察两药的化疗增敏效应，寻找较为优化的治疗序贯；还通过体内实验观察了cetuximab和erlotinib单用或联合对HepG2和Bel-7402细胞裸鼠移植瘤模型的牛长抑制作用，及裸鼠对cetuximab联合erlotinib治疗的耐受性。通过上述研究内容，探讨cetuximab联合eriotinib靶向EGFR治疗肝癌患者的临床前景和价值。 第1章肝癌组织和癌旁肝组织中EGFR信号转导通路关键蛋白的表达及其临床意义1. 第2章 Cetuximab联合Erlotinib对人肝癌细胞系HepG2和Bel-7402的体外增殖抑制作用及其协同效应2. 第3章 Cetuximab联合Erlotinib对HepG2和Bel-7402细胞凋亡的影响 第4章Cetuximab联合Erlotinib对HepG2和Bel-7402细胞EGFR信号转导通路关键蛋白表达的影响. 第5章不同序贯的CetUXimab和Erlotinib与化疗药物联合对HepG2和Bel-7402细胞的体外增殖抑制作用 第6章Cetuximab联合Erlotinib对人肝癌移植瘤荷瘤裸鼠模型的体内作用研究. 结论： 1.肝细胞癌患者的肝癌组织和癌旁肝组织中都可检测到EGFR信号转导通路关键蛋白的高表达； 2.单因素生存分析表明肝癌组织中EGFR信号转导通路关键蛋白的激活与本组患者术后的无瘤生存时间和总生存时间有关；提示EGFR有可能作为肝癌治疗的有效靶点； 3.本组58例患者术后无瘤生存时间的独立影响因素是肿瘤最大径、肉眼癌栓、镜下子灶； 　　4.本组58例患者术后总生存时间的独立影响因素足肿瘤最大径、肉眼癌栓、病理分级、是否复发； 5.单药cetuximab和erlotinib在体外对人肝癌细胞系HepG2和Bel-7402的增殖都具有一定的抑制作用，联合应用时，二者具有明显的协同效应； 6.单药cetuximab和erlotinib能诱导HepG2和Bel-7402细胞发生凋亡，增加药物浓度和延长作用时间，细胞的凋亡率也随之增加，两药联合应用时，诱导HepG2和Bel-7402细胞凋亡的作用较单药时更强； 7.Cetuximab联合erlotinib诱导HepG2和Bel-7402细胞凋亡的机制有可能主要是通过减少p-Bad蛋白的表达实现的； 8.Cetuximab联合erlotinib对HepG2和Bel-7402细胞的协同抑制作用的分子机制主要是通过进一步下调EGFR信号转导通路活化关键蛋白的表达实现的； 9.Cetuximab和erlotinib与化疗药物联用对肝癌细胞的增殖具有协同抑制作用，较佳的给药序贯是化疗药物先于靶向药物给药，能获得明显的协同效应，这有助于临床用药时降低药物剂量，减少毒副作用。 10.HepG2和Bel-7402细胞荷瘤裸鼠对cetuximab联合erlotinib治疗的耐受性较好； 11.单药cetuximab和erlotinib对HepG2和Bel-7402细胞裸鼠移植瘤模型具有一定的抑制作用，两药联合，能更明显的抑制肿瘤生长，与对照组裸鼠相比具有统计学差异。