细胞自噬（Autophagy,简称自噬）是一种物质降解途径,广泛存在于真核细胞中。细胞自噬一般包括自噬的诱导、自噬前体的成核、自噬前体膜延伸、自噬前体的封口、自噬体的成熟、成熟的自噬体与液泡/溶酶体的融合等过程。细胞自噬过程受到一系列自噬相关蛋白（Autophagy-relatedproteins,Atg）的调控,这些蛋白作用于细胞自噬的各个阶段中,协同帮助货物顺利降解。此外,一些参与囊泡运输的蛋白对细胞自噬也有一定的调控作用,比如本实验室之前的实验结果发现在酿酒酵母中Rab5（Rasgenes from rat brain）的同源蛋白Vps21和转运必需内体分选复合物（Endosomal sorting complex required for transport,ESCRT）都参与了自噬前体的封口过程,进一步筛选发现ESCRT亚基Snf7通过与自噬相关蛋白Atg17的互作被招募至自噬前体,且Snf7-Atg17互作依赖于Vps21。如果vps21Δ中自噬前体不能封口的部分原因是因为Snf7-Atg17之间的互作变弱,那么人为迫使vps21Δ中Snf7-Atg17之间强行互作是否可以回补或部分回补该突变体的自噬缺陷表型?另外,Snf7又主要与Atg17的哪些结构域发生互作,且这类互作是否也能回补vps21Δ中的自噬缺陷表型?本研究主要探讨了 Vps21介导的Snf7-Atg17互作体系的意义,得到以下主要结果:1.用GBP-GFP介导Snf7-Atg17互作,可以部分回补Vps21缺失造成的自噬缺陷Vps21缺失导致Snf7与Atg17的互作减弱,在细胞内的共定位减少,同时该菌的自噬缺陷严重,产生未封口的自噬前体。本文尝试了二种不同的体系试图强行让Vps21缺失菌株中Snf7与Atg17互作。首先通过传统方法构建融合质粒,让Snf7与Atg17的碱基序列首尾相连形成融合蛋白,结果发现融合质粒中Snf7的功能丧失而无法实现目标。紧接着,本研究尝试了一种新的蛋白-蛋白互作方式,即利用GFP结合蛋白（GFP binding protein,GBP）对 GFP 的特异性亲和力,将 GBP 装在 Snf7 与 mCherry之间形成Snf7-GBP-mCherry,并整合到染色体上,再将被GFP标记的含Atg17的质粒亦整合在酵母染色体上共同表达,由于GBP和GFP相互靠近,从而实现即使在vps21Δ突变体中Snf7与Atg17也能互作的目的。通过荧光观察以及免疫印迹检测得知,缺氮条件下vps21Δ突变体中Snf7与Atg17的共定位得到加强,Ape1的成熟缺陷得到较大恢复。同时另一货物蛋白Ams1在Snf7与Atg17共定位的vps21Δ突变体与野生型这一组中的相对降解量,与无Snf7与Atg17共定位的对照组相比发生了显著下降,极有可能是通过自噬增加了降解。2.Atg17的α3-α4结构域对Snf7-Atg17的互作十分重要之前本实验室的研究已了解到Snf7与膜结合的结构域对Snf7与Atg17的互作非常重要,本文将进一步探讨Atg17的不同结构域与Snf7互作的情况。依据文献将Atg17分为α1-α4四个结构域,通过构建双分子荧光互补质粒开展实验,得出Atg17的α3-α4结构域对Snf7-Atg17的互作非常关键,且这类互作依旧发生在自噬前体上,但是通过功能验证实验发现这类结构域不足以恢复αtg17Δ中的自噬缺陷,说明Atg17的其他结构域对Snf7与Atg17互作后自噬功能的发挥也是至关重要的。以上实验结果说明,依赖于Vps21的Snf7-Atg17互作对自噬前体封口具有非常重要的意义,因为人为迫使Snf7与Atg17互作能部分回补Vps21缺失导致的细胞自噬缺陷。此外,虽然Atg17的α3-α4结构域也可以与Snf7发生互作,但这些结构域不足以恢复a这17Δ中的自噬缺陷。这些结果对Snf7-Atg17互作参与自噬前体封口的分子机制提供了有力的实验证据,也为今后研究类似的问题提供了方法和参照。