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在药物释放体系中,与单靶向高分子药物载体相比,双靶向高分子药物载体不仅具有进一步选择性地进入肿瘤细胞和提高肿瘤等病变部位的药物浓度等特点,而且能有效地避免单一靶向配体被干扰而影响靶向效果。比如小鼠脑胶质瘤细胞(C6)表面同时表达转铁蛋白靶向受体(transferrin receptor,Tf R)和叶酸受体(folate receptor,FR),因此含转铁蛋白(Transferrin,Tf)和叶酸(Folic acid,FA)双靶向配体的高分子药物载体有望可以更有效地被脑肿瘤细胞所摄取。本论文设计将生物素(Biotin)修饰的普朗尼克F127-聚乳酸三嵌段共聚物(Biotin-F127-PLA)和叶酸修饰的普朗尼克F127-聚乳酸三嵌段共聚物(FA-F127-PLA)物理混合,通过纳米沉淀法得到Biotin(FA)-F127-PLA纳米粒子。然后利用生物素-亲和素三步法偶联技术实现转铁蛋白和叶酸的双靶向行为。三步法步骤具体如下:第一步,生物素化的转铁蛋白与小鼠脑胶质瘤细胞表面过度表达的Tf R相结合;第二步,亲和素与生物素化的转铁蛋白特异性结合;第三步,Biotin(FA)-F127-PLA纳米囊泡与亲和素相结合。由于生物素与亲和素之间高强度的非共价结合,基于以上三步法实现的转铁蛋白和叶酸双靶向行为不易受到外源性化学反应的影响,且此偶联技术在其他靶向配体的链接和细胞荧光成像等方面也有广泛的应用。通过透射电镜,我们观察到双靶向前体物Biotin(FA)-F127-PLA纳米粒子为具有双层结构的球形囊泡。其次,通过激光粒度仪测定得到此纳米囊泡的粒径主要分布在30-70 nm,且粒径较均一。这为包埋疏水性抗癌药物紫杉醇(paclitaxel,PTX)提供了可能性,且有利于肿瘤细胞对双靶向高分子纳米囊泡的摄取。通过将PLA-F127-PLA/PTX、FA-F127-PLA/PTX、Biotin-F127-PLA/PTX和Biotin(FA)-F127-PLA/PTX囊泡在模拟血液中实施释放行为,我们发现负载紫杉醇的纳米囊泡的释放呈现为先突释后缓释的行为。在材料的细胞相容性研究中,通过MTT法测试,我们发现PLA-F127-PLA、FA-F127-PLA、Tf-F127-PLA和Tf(FA)-F127-PLA这四种共聚物材料对C6细胞几乎没有毒性。同时,在负载紫杉醇的高分子纳米囊泡的体外毒性研究中,我们发现这四种负载紫杉醇的纳米囊泡对C6细胞的毒性为Tf(FA)-F127-PLA/PTX>FA-F127-PLA/PTX>Tf-F127-PLA/PTX>PLA-F127-PLA/PTX。含转铁蛋白和叶酸双靶向的纳米囊泡在对C6细胞的抗肿瘤毒性中表现出明显的优势。在细胞荧光实验中,我们以C6细胞作为模型细胞,香豆素-6(coumarin-6,C-6)作为荧光探针来探究纳米囊泡在C6细胞中的摄取情况。荧光显微镜定性实验结果表明,纳米囊泡主要被C6细胞摄取进入细胞质中。细胞定量吸收实验结果显示,C6细胞摄取四种纳米囊泡的摄取量为Tf(FA)-F127-PLA/C-6>FA-F127-PLA/C-6>Tf-F127-PLA/C-6>PLA-F127-PLA/C-6,这与含转铁蛋白和叶酸双靶向高分子纳米囊泡对C6细胞具有更强的细胞毒性结果相一致。在此基础上,我们进一步探究了C6细胞对纳米囊泡的摄取机制。实验结果表明,C6细胞摄取纳米囊泡是一种依赖能量的主动内吞机制,其与网格蛋白、小窝蛋白、N+/H+交换体,内质网到高尔基体的转运和核内体到溶酶体的转运有关。此外,数据也证明C6细胞摄取纳米囊泡与FA受体和Tf受体两者介导的内吞有关。综上所述,含FA和Tf双靶向配体的高分子囊泡在脑肿瘤等复杂疾病方面具有较好的应用潜力和前景。