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登革病毒(dengue virus,DV)属于黄病毒属的单链正股RNA病毒,是一种广泛流行的虫媒病毒。依据E蛋白(envelope protein,包膜蛋白)抗原性不同,DV可分为四个血清型(DV1～4)。DV感染可导致登革热(denguefever,DF),主要表现为发热、头痛和眼眶痛。少数病人可能发展为危及生命的登革出血热(dengue hemorrhagic fever,DHF)和登革休克综合征(dengue shock syndrome,DSS)。研究显示:在严重登革热及DHF/DSS病人,除出血等临床表现外,常有肝肿大、黄疸、转氨酶水平升高等体征,细胞实验也证实,人肝癌细胞株HepG细胞能够支持DV的复制,提示肝脏可能是DV感染的重要靶器官。但DHF/DSS肝损害的发病机制尚未完全阐明。细胞内氧化还原状态失衡被认为与病毒感染和其导致的疾病发展过程有关。最近有研究发现DV感染病人有氧化损伤的表现,提示氧化应激可能在DV致病过程中发挥重要作用。还原型谷胱甘肽(glutathione,GSH)是广泛存在于体内重要的胞内抗氧化物,且肝脏是合成GSH的重要器官。前期体外研究中我们发现,DV2感染后可引起细胞内GSH水平降低,添加外源性GSH可以调节NF-κB的活性从而抑制病毒在细胞内的增殖。因此,在此基础上,本研究利用移植HepG2细胞的严重免疫功能缺陷(severe combined immunodeficiency,SCID)小鼠建立DV感染动物模型,在动物体内观察DV2感染是否可以导致氧化还原状态的失衡以及GSH等抗氧化剂对DV2感染的影响特别是对肝损害的保护作用。
1.DV2感染动物模型的建立
将5×106的HepG2细胞移植入SCID小鼠腹腔,并监测血清中人白蛋白(human albumin,hALB)的水平以验证移植成功。结果显示,移植后小鼠血清均可检出hALB,并随时间推移hALB水平逐渐升高。活组织检查可见所有小鼠腹腔内均有HepG2细胞团块生长。
移植后第10天腹腔注射DV2(Tr1751株,1×106PFU/只)进行攻毒实验,观察感染后小鼠感染病症的出现、血清和脏器病毒的检出率以及主要脏器病理改变。结果显示感染后小鼠陆续出现耸毛、倦怠、消瘦等表现,感染后第8天血清和肝脏中病毒检出率为100%,滴度达到103～105PFU/ml,而脑、脾脏和小肠的病毒检出率分别为85.7%(6/7)、71.4%(5/7)和57.1%(4/7),滴度均较低,少于103pFU/ml。主要脏器的组织学检查显示:与未感染对照组相比,DV2感染后小鼠肝脏呈现明显病理改变:有严重出血、淤血、炎症细胞浸润和水肿等病变,大脑有轻度充血,其它脏器病理改变不明显,提示本课题成功建立了小鼠DV感染模型,该模型可用于后续实验。
2.DV2感染后小鼠氧化还原状态的变化
为评价DV2感染后小鼠的氧化还原状态的改变,本实验检测了DV2感染后小鼠血清和组织中的总超氧化物歧化酶(T-SOD)、丙二醛(MDA)和过氧化氢酶(CAT)以及肝脏GSSG/GSH的比值。结果显示,与对照组相比,DV2感染后,血清和脏器(肝脏、脑、脾脏)中的MDA水平明显升高(p＜0.05);血清和肝脏的T-SOD活性明显降低(p＜0.01),脑和脾脏T-SOD水平变化不明显;肝脏的CAT活性明显降低(p＜0.05),但血清和其他组织中无明显变化;另外肝脏GSSG/GSH比值与对照组相比明显升高(p＜0.05)。另外,DV2感染后小鼠血清TNF-α和IL-6水平与对照组相比明显升高。上述结果提示,DV2感染可导致小鼠氧化应激的发生,而肝脏可能是DV2感染导致氧化损伤的主要靶器官。
3.GSH对DV2感染及其导致的氧化应激和肝损伤的抑制作用
为验证抗氧化剂对DV2感染导致的氧化应激是否有抑制作用,感染后按不同剂量、腹腔注射不同的抗氧化剂(GSH、NAC和VitC),每日1次,持续使用7天。于感染后第8天,取小鼠血清及脏器检测病毒载量。结果显示:抗氧化剂对病毒在血清和各脏器的检出率无明显影响,但高剂量GSH组(8mg/只/天)血清及脏器中病毒载量与未治疗组相比具有明显的下降趋势;作为GSH的前体物质,NAC处理组小鼠肝脏DV2病毒载量也呈现了一定的下降趋势。
同时检测上述氧化还原指标(MDA、SOD、CAT和GSSG/GSH比值):抗氧化剂作用DV2感染小鼠后,高剂量GSH组(8mg/只/天)小鼠血清及肝脏MDA水平明显下降(p＜0.05),T-SOD的活性明显提高;而低剂量的GSH(1mg、3mg/只/天)只对肝脏的T-SOD有提升作用;值得一提的是肝脏的CAT活性不仅在所有GSH处理组均有提高,在NAC处理组亦有明显提高;给予高剂量GSH还明显降低了肝脏GSSG/GSH比值;另外,GSH和高剂量NAC处理组(2mg/只/天)小鼠血清TNF-α和IL-6水平与对照组相比有明显降低。同时,组织学检查发现GSH处理还可以减轻DV2感染导致的氧化损伤,肝脏只出现轻度淤血和炎症细胞浸润。
上述结果提示,GSH可明显抑制DV2导致的氧化应激和肝损伤,同时GSH和NAC均可抑制DV2在肝脏的复制及DV2感染后炎症性细胞因子的分泌。
4、GSH抑制氧化应激的可能机制
为验证DV2感染对体外培养的HepG2细胞氧化还原状态的影响以及抗氧化剂的作用,利用DCFH-DA探针法检测DV2感染后以及抗氧化剂作用后细胞内活性氧(reactiveoxygenspecies,ROS)水平,结果发现,与对照组相比,感染后HepG2细胞内荧光强度明显增强,提示ROS水平明显升高。抗氧化剂(20mMGSH、50μMNAC和50μMVitC)可明显降低感染后24h和48h细胞内的ROS水平,而0.2mMBSO(GSH合成酶抑制剂)则可增强感染后细胞内ROS的产生。
以往研究已证明GSH能够抑制DV2在HepG2内的复制和释放,为此本实验进一步观察了抗氧化剂(20mMGSH、50μMNAC和50μMVitC)和0.2mMBSO对DV2进入细胞的影响,以期揭示抗氧化剂降低感染动物体内病毒载量的可能机制。结果显示,与对照组相比,GSH处理组细胞内病毒约降低50%,而BSO处理组细胞内病毒升高30%以上,NAC和VitC对病毒进入无明显影响,提示添加外源性GSH可抑制DV2进入宿主细胞。
以上结果表明无论是动物实验还是体外实验,DV2感染均可导致氧化应激,外源性添加GSH可一定程度上抑制DV2感染及其引起的氧化损伤,这种抑制作用可能是由于干扰了DV2进入宿主细胞及其在其中的复制,进而抑制了炎症性细胞因子的释放及其所引起的组织脏器的损害。本研究为GSH用于DV感染后肝损伤的辅助治疗提供了理论依据。