哺乳动物肠腔被覆一层黏膜上皮细胞,这些黏膜上皮细胞每4-5天更新一次,这种快速更新和肠上皮干细胞密切相关。肠上皮干细胞可分化出各种肠黏膜上皮成熟细胞。肠上皮干细胞不仅在肠黏膜上皮的正常新陈代谢中起关键作用,而且也能修复损伤的肠黏膜上皮。如果肠上皮干细胞受到不可逆的损害,则肠道损伤黏膜的修复将变得十分困难,进而引起严重的全身系统损伤。严重的肠道黏膜损伤需要干细胞移植治疗才可能修复。　　 肠上皮干细胞具有增殖和自我更新的能力,又可产生各种成熟肠上皮细胞,因此是治疗肠道疾病的理想细胞。目前没有获取肠上皮干细胞的理想方法,最大的障碍是没有可靠的肠上皮干细胞标志,无法获得足够的肠上皮干细胞用于研究和治疗。研究发现Musashil是一个候选的肠上皮干细胞标志基因,对Musashil的研究有利于推动肠上皮干细胞和肠黏膜损伤治疗的研究。　　 Musashil蛋白是一种高度保守的RNA结合蛋白,是细胞不对称分裂的关键调节子,作为一种神经干细胞的标志,在干细胞的维持、分化和肿瘤形成中扮演重要角色。研究者注意到许多小肠黏膜隐窝表达Musashil,Musashil阳性细胞位于潘氏细胞之上并紧连于潘氏细胞的几个细胞,Musashil阳性细胞在肠上皮隐窝的普遍表达以及合适的表达数量都暗示这些Musashil阳性细胞是肠上皮干细胞和/或者祖细胞。肠上皮干细胞在Musashil基因作用下分裂为两个细胞:一个细胞维持干细胞性质,停留于肠上皮干细胞原来的位置,分裂产生的另一个细胞作为肠上皮的短暂扩增细胞。这个短暂扩增细胞离开原来位置,继续增殖并逐渐分化,产生潘氏细胞、吸收上皮细胞、神经内分泌细胞和杯状细胞。　　 最近的研究显示,小肠黏膜隐窝中的Musashil阳性细胞不仅仅是存在于潘氏细胞之上,也存在于潘氏细胞之间。这些细胞所处位置就是另一些新出现的候选肠上皮干细胞标志基因,例如leucine-rich repeat-containing G protein-coupledreceptor5(Lgr5)阳性细胞的出现部位。进一步证明Musashil可以作为肠上皮干细胞,或者至少是祖细胞的候选基因。Musashil的进一步研究受阻于缺少足够的Musashil阳性细胞,目前无法从肠黏膜上皮获取足够的Musashil阳性细胞,迫切需要获取大量Musashil阳性细胞的方法。小鼠胚胎干细胞的研究进展为获取大量Musashil阳性细胞提供了可能。　　 胚胎干细胞(Embryonic stem cells,ESCs)具有旺盛的增殖扩增能力和全能的分化能力,可发育成机体所有类型细胞,在一些严重疾病的治疗上有独特的优势。经过诱导分化或者组织工程处理后,胚胎干细胞的分化细胞可以用于治疗诸如神经变性疾病、糖尿病、心脏病、重症肝病、烧伤等。目前,已从ESCs诱导出神经上皮细胞、心肌细胞、血细胞、血管内皮细胞、脂肪细胞、肝细胞、骨细胞和胰腺β细胞等。　　 PI3K/Akt信号通路对ESCs的自我更新、增殖和分化有重要影响。ESCs的培养基含有多种能激活P13K/Akt信号通路的物质,在分化过程中研究PI3K/Akt信号通路显得更为重要。抑制PI3K/Akt信号通路有利于ESCs向中内胚层分化,从而可能分化出更多Musashil阳性细胞。　　 我们前期研究已经发现在小鼠胚胎干细胞(mouse ESCs,mESCs)分化过程中有Musashil表达,如果能从mESCs分化细胞中筛选出Musashil阳性细胞,无疑将有利于对Musashil基因和肠上皮干细胞的研究。　　 研究目的:　　 本研究在培养mESCs基础上,在mESCs分化细胞中检测Musashil的表达规律。构建了Musashil启动子报告基因载体,利用所构建的载体转染mESCs分化细胞,从中筛选出Musashil阳性细胞,并对Musashil阳性细胞的分化能力做了初步研究。观察抑制mESCs的PI3K/Akt信号通路能否增加mESCs分化过程中Musashil阳性细胞的数量。　　 研究内容和方法:　　 1.采用饲养层和无饲养层两种方式培养E14tg2a系mESCs,采用悬滴培养法培养拟胚体。　　 2.以荧光定量PCR和western blot技术在mRNA和蛋白两个水平检测E14tg2a细胞分化过程中Musashil的表达。　　 3.提取和鉴定Musashil启动子报告基因载体pMSI1-GFP。　　 4.用脂质体转染技术,转染pMSI1-GFP入E14tg2a分化细胞,应用流式细胞仪检测GFP阳性表达率。　　 5.将pMSI1—GFP转染入E14tg2a第11天分化细胞,以流式细胞仪分选出Musashil阳性细胞。　　 6.将分选出的Musashil阳性细胞、阴性细胞和未分选细胞继续体外培养,以荧光定量PCR技术检测各组第16天分化细胞的神经细胞标志基因(Nestin、TubulinβⅢ)和肠上皮细胞标志的基因(Musashil、Lyz、TFF3)的表达。　　 7.将分选出的Musashil阳性细胞、阴性细胞和未分选细胞注射入NOD/SCID小鼠背部皮下,了解移植物的形成能力；以荧光定量PCR技术检测各组移植物中的神经细胞标志基因(Nestin、TubulinβⅢ)、中胚层标志基因(Pax6、PDGFR-α)和肠上皮细胞标志(Villin、FABP2、ChA、Lyz、TFF3)的表达；以免疫组化技术检测Nestin、Villin、FABP2的表达情况。　　 8.探讨不同浓度LY294002对E14tg2a细胞增殖的影响。以western blot检测LY294002对E14tg2a细胞糖原合成酶激酶(GSK)Ser9磷酸化蛋白的影响。　　 9.LY294002组和EB组第5天拟胚体分化能力的检测(GSC、Brachyury、Cxcr4、Sox17、Sox9、TBX6、Sox2)。　　 10.流式细胞仪检测LY294002组和EB组E14tg2a第5天分化细胞中Cxcr4阳性细胞比率。　　 11.检测LY294002组和EB组E14tg2a第16天分化细胞的神经细胞标志基因(Nestin、Sox2、TubulinβⅢ)、中胚层标志基因(Pax6)和肠上皮细胞标志基因(Musashil、Lgr5、Lyz、TFF3)的表达。　　 12.LY294002组和EB组E14tg2a分化细胞的Musashil表达及pMSI1-GFP的转染。　　 13.LY294002组和EB组E14tg2a第10天分化细胞注射到NOD/SCID小鼠背部皮下形成移植物。以荧光定量PCR技术检测移植物中的神经细胞标志基因(Nestin、TubulinβⅢ)、中胚层标志基因(Pax6、PDGFR-α)和肠上皮细胞标志基因(Musashil、Villin、FABP2、ChA、Lyz、TFF3、Lgr5)的表达。以免疫组织化学技术检测TubulinβⅢ和Villin蛋白的表达情况。　　 实验结果:　　 1.在饲养层和非饲养层上均可顺利培养E14tg2a细胞,细胞排列呈巢状,细胞小而致密。应用悬滴培养能顺利产生拟胚体,在5x105/ml细胞浓度下,所形成的胚体大小一致,边缘光滑。　　 2.Musashil mRNA在mESCs第11天分化细胞相对表达量达到5.54±0.19,高于其余各组。第10和11天分化细胞Musashil蛋白wesmrn blot条带灰度分别是1.56±0.46和1.13±0.25,高于其余组。在Musashil表达最高峰后,Musashil仍在稍低水平持续表达。　　 3.序列分析显示所构建的质粒pMSI1-GFP包含Musashil启动子片段,启动子片段插入在质粒的多克隆位点。　　 4.mESCs和第7、10天分化细胞转染pMSI1-GFP,24小时后GFP阳性率分别为0.4±0.06％,0.8±0.05和25.7±6.40％。第10天分化细胞转染后GFP阳性率最高。　　 5.GFP阳性细胞和GFP阴性细胞的Musashil mRNA相对表达量分别为15.9±3.40和0.8±0.20；GFP阳性细胞可检测到Musashil蛋白表达,GFP阴性细胞未见Musashil蛋白。GFP阳性细胞可以认为是Musashil阳性细胞。　　 6.在贴壁培养条件下,分选出的Musashil阳性和阴性细胞的神经细胞和肠上皮细胞标志基因的mRNA表达没有显著性差异。　　 7.Musashil阳性细胞组移植物Nestin、TubulinβⅢ、Villin、FABP2、Lyz、TFF3、ChA、Pax6和PDGFR-αmRNA相对表达量为0.685±0.033,1.800±0.218,1.119±0.209,0.281±0.028,0.0006±0.00004,0.015±0.003,0.038±0.001,0.024±0.009和0.9097±0.139；而Musashil阴性细胞组移植物相应为0.254±0.110,1.056±0.157,0.6275±0.112,0.201±0.005,0.0002±0.0007,0.016±0.003,0.027±0.002,0.117±0.040和1.757±0.254。Musashil阳性细胞组移植物神经细胞标志基因(Nestin、TubulinβⅢ)、肠上皮细胞标志基因(Vitlin、FABP2、Lyz、ChA)mRNA表达高于Musashil阴性细胞组移植物,而中胚层标志基因(Pax6、PDGFR-α)mRNA表达低于Musashil阴性细胞组移植物。　　 8.相对于Musashil阳性细胞组,未分选细胞组和Musashil阴性细胞组移植物含有更多的软骨样组织。　　 9.未分选细胞组和Musashil阳性细胞组移植物的Nestin、Villin和FABP2阳性细胞表达多于Musashil阴性细胞组移植物。　　 10.western blot条带灰度比值(GSK-Ser9/GSK)在EB组和5μmol/L浓度LY294002组分别为0.568±0.180和0.015±0.004。5μmol/L浓度LY294002可以抑制E14tg2a细胞的PI3K/Akt信号通路。5μmol/浓度的LY294002轻度抑制E14tg2a细胞的增殖。　　 11.LY294002组第10天分化细胞Musashil mRNA相对表达量达到峰值(4.667±0.234),低于EB组第11天分化细胞Musashil mRNA相对表达量(5.540±0.190)。　　 12.相对于mESCs,EB组第5天拟胚体的GSC、Brachyury、Cxcr4、Sox17、Sox9、TBX6和Sox2 mRNA相对表达量分别为4.575±0.894,58.127±9.556,5.545±1.002,7.162±1.213,3.785±0.914,0.763±0.138和6.125±1.099；在LY294002组第5天拟胚体则分别为1.258±0.198,37.028±7.331,11.816±2.156,24.114±3.855,9.466±1.116,1.943±0.241和1.378±0.332。EB组、LY294002组分化第5天Cxcr4阳性细胞比率分别为2.13±0.65和5.90±1.24。LY294002组第5天分化细胞的内胚层标志基因(Cxcr4、Sox17)和中胚层标志基因(Sox9、TBX6)表达高于EB组,而中内胚层标志基因(GSC、Brachyury)和外胚层标志基因(Sox2)表达低于EB组。　　 13.相对EB组,LY294002组分化第16天细胞的Musashil、Lgr5、Nestin、Sox2、Pax6、Lyz、TFF3、TubulinβⅢ的mRNA相对表达量分别是0.428±0.105,4.832±0.622,0.268±0.035,0.327±0.093,17.500±2.443,2.353±0.246,0.050±0.010和0.126±0.023。EB组细胞的外胚层标志基因(Nestin、Sox2、TubulinβⅢ)的mRNA表达高于LY294002组,而EB组细胞的肠上皮细胞标志基因(Lgr5、Lyz)和中胚层标志基因(Pax6)的mRNA表达低于LY294002组。　　 14.EB组和LY294002组第10天分化细胞转染pMSI1—GFP后的GFP阳性细胞率为16.54±2.76和10.04±1.98。LY294002组低于EB组。　　 15.相对于EB组,LY294002组移植物的Villin、FABP2、Lyz、TFF3、ChA、Musashil、Lgr5、Nestin、TubulinβⅢ、Pax6和PDGFR-α的mRNA相对表达量为4.422±1.233,4.362±0.897,4.405±1.004,0.786±0.194,4.877±0.727,0.881±0.217,7.318±1.352,0.336±0.062,0.567±0.105,1.895±0.335和1.893±0.294。LY294002组移植物的肠上皮细胞标志基因(Villin、FABP2、Lyz、ChA、Lgr5)和中胚层标志基因(Pax6、PDGFR-α)高于EB组,而神经细胞标志基因(Nestin、TubulinβⅢ)低于EB组。　　 16.LY294002组移植物每个横截面含软骨样组织7±2.5个,高于EB组移植物(2±1.5个)。　　 17.LY294002组移植物表达更多的Villin阳性细胞和更少的TubulinβⅢ阳性细胞。　　 结论:　　 1.所构建的Musashil启动子报告载体pMSI1-GFP能追踪mESCs分化过程中Musashil基因的表达,并能用于从mESCs分化细胞中分选出Musashil阳性细胞。　　 2.自mESCs分化细胞中分选出来的Musashil阳性细胞比Musashil阴性细胞形成更多的神经样和肠上皮样细胞,并形成更少的软骨样细胞。　　 3.抑制PI3K/Akt信号通路可以促使mESCs向肠上皮和软骨样细胞分化,并减少向神经样细胞分化,但并不能增加Musashil阳性细胞数量。