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研究背景肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC,肝癌)是人类最常见的、高度恶性的肿瘤之一,位居全球恶性肿瘤发病率的第7位、肿瘤死因的第3位、我国第2位的肿瘤致死原因。因此,早诊断、早治疗,对提高肝癌患者的生存及预后极其重要。因此建立肝癌模型对肝癌研究的具有重要意义。腊肠、咸鱼等动物性腌制食品是我国居民喜食的一类食品,但其食用安全性越来越引起人们的关注。我国新颁布的膳食指南(2016年)第四条,推荐适量吃鱼、禽、蛋、瘦肉,烟熏和腌制肉类由于加工过程中易遭受一些致癌物污染,明确提出少吃或不吃。目前大量的流行病学表明经常吃腌肉食品等加工肉制品会增加肝癌、胃癌、结肠直肠癌等消化系统癌症的风险,并分析很可能和腊肠、咸鱼等动物性腌制食品摄入增加可能导致N-亚硝基化合物(英文全称、缩写)、苯并芘(BaP)等致癌物质摄入增加有关,但相关的实验室研究资料很少。因此本次研究通过用腊肠长期喂养实验大鼠,研究腌肉食品对大鼠消化系统的损害作用,并观察比较亚硝胺污染程度不同的腌肉制品对实验大鼠肝脏、食管、胃、结直肠等消化系统的损害作用,并分析判断这种损害是否主要是由亚硝胺引起的。研究目的1、用二甲基亚硝胺(N-nitrosodimethylamine,NDMA)做为化学诱导物,建立大鼠肝癌模型。2、研究长期摄入NDMA超标腊肠对大鼠消化系统的损害作用。3、分析摄入腊肠对大鼠消化系统的损害作用是否主要是由亚硝胺引起的。研究方法1、肝癌模型建立实验:6周龄雄性清洁级SD大鼠84只,体重198.4±16.2g,按体重随机分实验组(42只)和对照组(42只),实验组给予30μg/L二甲基亚硝胺(NDMA)饮用水任其自由饮用12周,12周后改为灭菌自来水,对照组一直给予灭菌自来水。整个实验持续36周,分别在实验的第2、4、6、8、10、12、16、20、24、28、32,每次处死3只大鼠,36周处死剩下全部大鼠,取肝脏和血清样本,肝脏立即做病理切片,观察病理变化。2、腊肠喂养实验:6周龄雄性清洁级SD大鼠180只,体重200.8±23.9g,按体重随机分5组,每组36只,分别为空白对照组(喂以AIN-93G饲料)、实验A组[喂饲料中腊肠(NDMA含量不超标)含量为18%(180g/kg)]、实验B组[饲料中腊肠(NDMA含量超标)含量为18%(180g/kg)]、实验C组[饲料中腊肠(NDMA含量超标)含量为36%(360g/kg)]和阳性对照组(喂以基础饲料,给予30μg/L NDMA饮用水任其自由饮用12周,12周后改为灭菌自来水),连续喂养33周,分别与第7、17、25、33周时各组处死8只大鼠,36周处理剩下大鼠,取肝脏、结肠、直肠、食管、胃并立即做病理切片,观察病理变化。3、统计学方法:所有数据用Excel建立数据库,原始数据使用SPSS 20.0统计软件进行录入、整理和分析。数据的整理分析使用频数、均数和标准差等进行统计描述。各实验组之间的肝炎评分和肝纤维化评分比较采用t检验或方差分析。研究结果1、肝癌模型建立实验:实验组大鼠肝组织切片在第6、16、24、32周时阳性组三只大鼠都分别出现了典型的肝炎、肝纤维化、肝硬化、肝癌的改变,并且整个诱导过程时间变化趋势明显,呈现出明显的时间梯度。2、腊肠喂养实验:空白对照组、实验A组、B组、C组大鼠和阳性对照组肝组织病理切片在第7、17、25和33周的肝炎评分结果如下:空白对照组:0±0→0±0→0.55±0.73→1.31±0.94;A 组:0.25±0.71→0.34±0.68→0.73±0.98→2.43±0.89;B 组:3.88±0.83→7.36±0.79→9.42±0.76→12.64±0.83;C 组:7.99±0.87→10.91±0.84→12.51±0.98→15.92±0.87;阳性对照组:11.11±0.96→14.32±0.87→ 15.43±0.92→ 17.65±0.99。将各实验组的第7、17、25和33周的肝炎评分分别与相应时间点的空白对照组实验大鼠的肝炎评分进行比较,实验B组和C组的肝炎评分均高于空白对照组,差异有统计学意义(P<0.01),且C组大鼠肝组织肝炎评分都比B组高;实验A组和B组大鼠肝组织病理切片的肝炎评分,在四个不同的时期差异都有统计学意义(P<0.01),且B组大鼠肝组织肝炎评分都比A组高;实验A组大鼠肝组织病理切片在第7、17和25周的肝炎评分与空白对照组差异无统计学意义(P>0.05),而在第33周的肝炎评分与空白对照组差异有统计学意义(P<0.01)。在实验第33周时,空白对照组中3(37.5%)只大鼠为肝炎,实验A组中5(62.5%)只大鼠出现了肝炎;实验B组中6(75%)只老鼠出现了肝炎,2(25%)只大鼠出现轻度肝纤维化;实验C组中2(25%)只大鼠出现了肝炎,5(62.5%)只大鼠出现轻度肝纤维化,1(12.5%)已经出现了肝硬化。阳性对照组中2(25%)只大鼠出现肝硬化,6(75%)只大鼠出现了肝癌。空白对照组、实验A组、B组和C组大鼠的食管、胃、结肠和直肠组织的病理切片在整个实验阶段均正常。仅阳性对照组大鼠出现结肠粘膜炎症,淋巴组织增生,肠粘膜上皮萎缩等病理改变。结论1、以30μg/LNDMA水溶液较长时间自由饮水的方式,在第32周成功地诱发大鼠形成肝细胞癌。2、NDMA诱发大鼠肝癌的毒性反应和肝脏损伤程度与人肝癌自然发病的过程相似,提示NDMA对肝有明显的亲和力,诱癌率高、较专一,是诱发肝癌和致癌性强的化学药物。3、长期摄入NDMA超标腊肠会导致大鼠发生肝炎、肝纤维化、肝硬化的风险增加,进而发展成肝癌,并且摄入越多的腊肠发生的风险越高。长期摄入NDMA超标腊肠对食管、胃、结肠和直肠组织无明显损伤作用。4、长期腊肠摄入导致的肝脏损害与伴随着腊肠摄入过量的亚硝胺(NDMA)摄入密切相关。