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植物免疫是植物在长期的进化过程中,对周边环境以及其它生物做出的一种防御反应,它是国际植物生物学研究的前沿热点领域。随着生物化学和分子生物学的发展,以及各种物理、生化技术的应用,植物免疫反应的研究逐渐深入。然而,过去有关植物免疫的大部分研究都在体外进行,而大量的实验数据表明体外实验未必能够完全揭示蛋白在活体中的实际情况。尽管前期的研究指出,拟南芥过敏性诱导反应蛋白(Hypersensitive induced reaction proteins,AtHIRs)在植物免疫过程中发挥重要功能,但对于AtHIRs参与植物免疫反应的分子机制仍不完全清楚。本研究以模式植物拟南芥(生态型:Columbia-0)为研究材料,以AtHIR1蛋白为研究对象,通过激光扫描共聚焦显微镜(Laser scanning confocal microscope,LSCM)和可变角度全内反射荧光显微镜(Variable-angle total internal reflection fluorescence microscope,VA-TIRFM)观察,发现AtHIR1主要定位于细胞质膜,与质膜标记蛋白LTi6a相比,AtHIR1在质膜上呈不连续定位,且分布不均一,表现出典型的膜筏标记蛋白的分布特征。使用抑制剂破坏膜筏后,AtHIR1的扩散系数和运动范围等均增大。通过双通道 VA-TIRFM 与 FLIM-FRET(Fluorescence lifetime imaging and Forster resonance energy transfer)等技术发现,AtHIR1与已知的膜筏标记蛋白REM1.3(Remorin 1.3)存在共定位和共扩散现象,且两者之间存在直接的互作。在蛋白动态分布和动力学特征方面,AtHIR1与REM1.3较为类似,而与另一个膜筏标记蛋白Flot1存在明显区别,说明AtHIR1与REM1.3标记的膜筏存在部分重叠,推测AtHIR1标记的膜筏可能与REM1.3具有某些类似的生物学功能。在共表达细胞骨架标记蛋白TUA5(Tubulin alpha-5)与AtHIR1的双标材料中,AtHIR1的运动明显被局限于微管形成的隔区内,而且在一定程度上,其运动也受到微丝骨架的影响;细胞骨架抑制剂处理实验进一步验证了该结论。更为重要的是,通过对荧光漂白步数和荧光强度的统计分析发现,质膜上AtHIR1存在同源寡聚化,在用M[3CD、Oryzalin、LatB等抑制剂破坏膜筏或细胞骨架以后,膜上AtHIR1的密度显著增大、寡聚化程度显著降低;蓝绿温和胶分析显示,AtHIR1在540 kD以上的复合体中表达量较高;在用flg22处理后,AtHIR1在该复合体中的含量显著增加。而当破坏膜筏或细胞骨架后再与flg22共孵育时,AtHIR1在该复合体中的含量显著降低。蛋白质谱结果发现,植物免疫相关蛋白AHA2是AtHIR1 相关复合体中的组成成分,通过荧光互相关光谱(Fluorescence cross-correlation spectroscopy,FCCS)和蛋白接近指数(Protein proximity index,PPI)等技术分析发现,膜筏和细胞骨架的破坏可以显著地降低AtHIR1与AHA2之间的相关性。综上所述,本研究采用细胞生物学方法,并结合生化手段对拟南芥AtHIR1蛋白进行研究,发现:(1)AtHIR1主要定位于细胞质膜,并与膜筏标记蛋白REM1.3共定位,并且两者可以直接互作;(2)膜筏和细胞骨架影响膜上AtHIR1蛋白的侧向运动;(3)AtHIR1蛋白的寡聚化和免疫相关复合体的形成需要完整的膜筏和细胞骨架。上述结果揭示了膜筏和细胞骨架在调控AtHIR1的动力学、寡聚化,以及植物免疫相关复合体形成中的作用,为进一步阐明植物免疫反应的分子机理提供了理论参考。