传统中医认为枸杞具有“滋阴补血,益精明目”等功效,现代药理学研究表明枸杞具有明显的免疫调节作用,多糖是其发挥作用的主要物质基础。前期药理研究表明,枸杞多糖蛋白复合物4 (LBPF4)是枸杞发挥免疫调节作用的活性成分之一,其经过蛋白酶消化后所获得的均一多糖LBPF4-OL也具有明显的免疫调节作用。前期化学研究表明,LBPF4-OL是由鼠李糖、阿拉伯糖和半乳糖三种单糖组成,其平均分子量为181KD。本课题的主要目的是研究LBPF4-OL的免疫调节靶细胞,寻找其靶细胞作用位点,并观察LBPF4-OL酸裂解后产物是否具有活性。多糖免疫调节靶细胞主要为固有免疫(innate immune)系统的抗原递呈细胞(antigen processing cell)和体液免疫系统的的B淋巴细胞,而对T细胞的报道相对较少。TLR4是第一个被鉴定与哺乳动物同源的果蝇Toll样蛋白,它既能够识别革兰氏阴性菌脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)和主要源于革兰氏阳性菌的肽聚糖(eptidoglycan,PG),也能识别内源性的透明质酸等。日本和韩国学者则发现,TLR4可能是中草药多糖成分在体内的主要作用位点。当前研究表明,β-葡聚糖的受体Dectin-1可能是目前发现的唯一多糖特异性受体,而TLR4和其它一些多糖活性相关蛋白,如TLR2、CR3、SR和CD19等,可能只是能够识别多糖的非特异性受体。因此,在确定免疫调节靶细胞的基础上,本研究拟从上述已知受体为切入点,筛选和鉴别LBPF4-OL在靶细胞上可能的受体或作用位点。一、LBPF4-OL免疫调节靶细胞研究1.均一多糖LBPF4–OL的分离和纯化首先采用水浸和醇沉的方式获得了枸杞粗多糖,然后采用DEAE-纤维素柱层析法获得LBPF1、LBPF2、LBPF3、LBPF4和LBPF5五个组分,其中LBPF4在490nm和280nm处均存吸收峰,表明LBPF4是多糖蛋白复合物。进而采用Pronase E裂解蛋白从而释放LBPF4中的糖链,并采用高效凝胶渗透色谱法(HPGPC)观察LBPF4中糖链的均一性。结果发现,LBPF4–OL经处理可得到单一对称峰,表明所获得的LBPF4-OL是均一多糖。2. LBPF4–OL免疫调节靶细胞研究首先采用淋巴细胞增殖实验和流式细胞术(flow cytometry,FCM)观察了在T、B淋巴细胞和巨噬细胞混合存在时LBPF4-OL对淋巴细胞活化和增殖功能的影响,进而采用磁性分选方法,分离纯化了淋巴细胞,并分别观察LBPF4-OL对这三种细胞各自功能的影响,同时探讨了LBPF4-OL的免疫调节作用特点。采用脾细胞观察LBPF4-OL对淋巴细胞增殖的影响,结果表明,LBPF4-OL在50和100μg/mL浓度时可明显提高脾细胞3H-TdR掺入值,当与LPS合用时,可在其基础上进一步提高掺入值,而当与Con A合用时,对脾细胞3H-TdR掺入值无明显影响。进一步采用磁性分选的方法获得纯度分别在90%及95%以上T、B淋巴细胞,观察LBPF4-OL对T、B细胞的直接影响。结果表明,LBPF4-OL对T细胞和B细胞自发增殖均无明显影响,但当其与LPS合用时,或者向B细胞中加入巨噬细胞时,LBPF4-OL则可明显促进B细胞3H-TdR掺入值。结果提示,LBPF4-OL对脾细胞中T和B细胞增殖无直接影响,但可在巨噬细胞或LPS存在时促进B细胞增殖。淋巴细胞的活化是发生增殖和转化的前期事件,细胞因子则是淋巴细胞增殖的必要条件之一。为进一步观察LBPF4-OL对T、B细胞活化及对细胞因子分泌的影响,我们将LBPF4-OL与脾细胞共培养24 h,然后分别采用FCM和液相芯片分析技术(luminex assays)进行了观察。流式细胞术检测结果表明,LBPF4-OL对CD3+T中CD3+CD25+T细胞和CD19+B中CD19+CD86+B细胞的比例均无明显影响。Luminex测定结果表明,LBPF4-OL只有在高浓度,即100μg/ml时可增加细胞因子IL-2的分泌,而在低、中、高各浓度时对细胞因子IL-13的分泌均无明显影响。同时我们发现,LBPF4-OL对主要来源于巨噬细胞的TNF-等细胞因子具有明显的浓度依赖性促进作用,在100μg/ml时对GM-CSF、IL-12p40的分泌也有明显的促进作用。综合以上结果提示,LBPF4-OL单独应用对T细胞增殖和活化均无明显影响,对B细胞活化无明显影响,但与LPS及巨噬细胞合用可明显诱导B细胞增殖,还能明显诱导巨噬细胞型细胞因子释放,提示巨噬细胞和B细胞可能是其免疫调节靶细胞。在上述研究基础上,观察了LBPF4-OL体内及体外给药对巨噬细胞功能的影响。体内实验中,小鼠腹腔给药1次/天,连续6天,末次给药后收集腹腔巨噬细胞,采用流式细胞术观察细胞CD86及MHC-Ⅱ的表达变化。结果表明,LBPF4-OL能明显增加CD11b+CD86+细胞及CD11b+I-A/I-E+细胞的数量,提示它能活化巨噬细胞并增强其抗原递呈能力。体外实验中,分别观察了LBPF4-OL对促炎因子和抗炎细胞因子分泌的影响。采用ELISA法测定腹腔巨噬细胞培养上清中促炎细胞因子TNF-及IL-1β含量,结果表明,而LBPF4-OL能够浓度依赖性诱导它们的分泌,而葡聚糖(glucan,100μg/ml)对其分泌无明显影响;采用RT-PCR法测定腹腔巨噬细胞培养上清中抗炎细胞因子IFN-及IFN-βmRNA表达量,结果表明,LBPF4-OL能够时间依赖性诱导IFN-及IFN-βmRNA表达,二者的表达量均在24 h达高峰。以上结果表明,LBPF4-OL一方面能诱导B淋巴细胞的增殖,另一方面还能活化巨噬细胞并增强其抗原递呈能力,而且能直接增强其免疫调节功能,提示B淋巴细胞和巨噬细胞是其主要的免疫调节靶细胞。二、LBPF4-OL在靶细胞的分子作用位点研究在本部分的研究中,我们首先分别在B及巨噬细胞上对CD19、TLR4、TLR2和CR3四种多糖作用位点进行了筛选,然后以基因突变小鼠为研究对象,采用~3H-TdR掺入法及生物膜干涉等技术对其中主要作用位点进行了验证。1. LBPF4–OL在B细胞上作用位点的研究CD19是B细胞BCR分子的共受体(coreceptor),具有调节B细胞活化域值的作用,而TLR4是报道最多的多糖作用位点。为了观察CD19和TLR4是否为LBPF4-OL在B细胞的作用位点,我们采用激光共聚焦、流式细胞术和3H-TdR掺入法观察了LBPF4-OL对B细胞的影响。结果显示,LBPF4-OL提前与分离的B淋巴细胞反应9 min,3 min和1 min后,能够降低B细胞膜CD19分子荧光标记抗体的数量,流式细胞术检测发现,LBPF4-OL提前与B细胞反应9 min后,B细胞膜PE-anti-CD19分子平均荧光强度下降了27.1%。并且我们发现,anti-CD19在浓度为0.00625μg/ml时就能显著抑制LBPF4-OL与LPS合用所诱导的脾细胞增殖,在0.1μg/ml时抑制率可达到58.1%。Anti-TLR4/MD2在浓度为0.0625μg/ml时也能明显抑制LBPF4-OL与LPS合用所诱导的脾细胞增殖,在1μg/ml时抑制率可达到25.1%。上述实验结果提示,CD19和TLR4分子可能都是LBPF4-OL在B细胞的作用位点。2. LBPF4–OL在巨噬细胞上作用位点的研究TLR4和TLR2是与多糖活性密切相关的两种TLRs,并且在巨噬细胞膜上表达量丰富。CR3曾经一度被作为单核巨噬细胞激活的标志,后来发现部分多糖活性也与该受体有关。为了观察TLR4、TLR2和CR3是否为LBPF4-OL在巨噬细胞的作用位点,我们采用抗体封闭法观察了anti-TLR4、anti-TLR2和anti-CR3对巨噬细胞分泌TNF-和IL-1β的影响。结果表明,5μg/ml的LPS以及100μg/ml的LBPF4-OL都能显著诱导TNF-和IL-1β分泌,而半乳聚糖Galactan对TNF-和IL-1β分泌无明显影响;Anti-TLR4能够浓度依赖性抑制LBPF4-OL诱导的TNF-和IL-1β分泌,Anti-TLR2(0.31,0.62,1.25,2.5μg/ml)只有在0.62μg/ml浓度以上时能抑制TNF-分泌,且各有效浓度抑制率无明显差异,但能够浓度依赖的抑制IL-1β分泌,Anti-CR3对TNF-和IL-1β分泌均无明显影响。为了进一步明确TLR4和CR3是否为其作用位点,我们采用3H-TdR掺入法观察了anti-TLR4/MD2和anti-CR3对LBPF4-OL促脾细胞增殖的影响。结果表明,LBPF4-OL能够浓度依赖的诱导脾细胞增殖,anti-CR3对LBPF4-OL诱导的脾细胞增殖无明显影响,anti-TLR4/MD2在浓度为0.0625μg/ml时即可明显抑制各浓度LBPF4-OL所诱导的脾细胞增殖,提示TLR4可能是LBPF4-OL的作用位点。上述实验结果表明,TLR4可能是LBPF4-OL在巨噬细胞上的主要作用位点之一。为进行进一步证明,我们又采用TLR4基因突变小鼠和生物膜干涉等多种方法进行了验证。首先,观察了LBPF4-OL对TLR4基因突变小鼠C3H/HeJ腹腔巨噬细胞分泌TNF-和IL-1β的影响。结果表明,LBPF4-OL能浓度依赖的诱导正常小鼠C3H/HeN腹腔巨噬细胞分泌TNF-和IL-1β,但对C3H/HeJ小鼠TNF-和IL-1β分泌无影响。进而观察了LBPF4-OL对C3H/HeN及C3H/HeJ小鼠脾细胞增殖的影响。结果表明,LBPF4-OL能明显诱导C3H/HeN小鼠脾细胞增殖,但诱导C3H/HeJ小鼠脾细胞增殖的作用明显降低。上述结果进一步说明,LBPF4-OL对巨噬细胞和脾细胞功能的调节与TLR4密切相关。然后采用生物膜干涉技术在分子水平观察LBPF4-OL与TLR4/MD2复合物是否存在直接结合。初步实验结果表明,LBPF4-OL能够与TLR4发生直接结合,按平均分子量181×103 D来计算,其亲和力KD(M)值为4.5×10-7mol,而与半乳聚糖和酸性多糖CA4-3(半乳糖醛酸聚合物)不能与TLR4结合。这部分结果初步证实,TLR4确实是LBPF4-OL直接结合位点之一。三、荧光标记LBPF4-OL及其裂解产物免疫活性评价目前的研究认为,多糖的生物活性与化学修饰,以及多糖分子量的大小、聚合度、溶液中的高级构象改变等因素有关。恰当的化学修饰会增强多糖活性,反之还会使多糖活性丧失,而分子量太大或太小也会影响多糖活性,并且许多多糖的活性依赖于一定的分支度(degree of branch,DB)。为了明确LBPF4-OL的分支是否为其活性所必须的,我们采用3H-TdR掺入法对去除支链后的LBPF4-OL进行了活性评价。结果显示,去除支链后的LBPF4-OL在10,50和100μg/ml时均无明显促脾细胞增殖作用。为了明确分子量的改变是否会影响LBPF4-OL的活性,我们采用相同的实验方法对LBPF4-OL经酸裂解后所获得的低聚寡糖进行了活性评价。结果表明,该低聚寡糖促脾细胞增殖活性也完全丧失。以上结果提示,保留结构中的支链并维持一定的聚合度是LBPF4-OL活性所必需的。通过以上研究我们主要得出如下结论:i.枸杞多糖LBPF4-OL在小鼠的免疫刺调节靶细胞主要为巨噬细胞和B淋巴细胞,其靶细胞作用范围与蛋白多糖LBPF4相比较明显缩窄。ii.本研究首次报道,TLR4是枸杞多糖LBPF4-OL在巨噬细胞上的主要结合位点,TLR2可能也是其作用位点之一。CD19和TLR4可能是LBPF4-OL在B细胞的作用位点。iii.保留LBPF4-OL结构中的支链并形成一定的聚合度是该多糖活性所必需的。