背景临床上,多种原因所致的关节软骨损伤十分常见。尽管有许多种治疗措施,但尚无金标准的临床治疗路径,文献提示还不能确立哪种治疗手段比其它更具优越性。目前关于软骨缺损的治疗策略之一是移植间充质干细胞再生修复软骨。经关节腔注射间充质干细胞疗法是目前最微创的给药途径之一。尽管有文献报道指出这种技术可以修复关节软骨损伤,但这种技术的修复效果并不十分理想。其主要问题在于:从注射点到达软骨损伤部位存在一定的距离,缺少特异的干细胞归巢机制,干细胞主动迁移到损伤部位的效率十分低下。此外,由于关节滑液的稀释作用,移植的干细胞很难在损伤部位定居。最终,仅仅只有少部分移植的干细胞贴附在软骨损伤部位发挥修复作用。大多数移植的干细胞是贴附在滑膜组织或者游离在关节液中,不仅发挥不了治疗作用,反而还会诱发滑膜增生,增加滑膜炎、游离体等并发症的风险。目前大多数的研究方向都是以干细胞的功能和生物学特性为焦点,而不是干细胞的传递策略。众所周知,合适的干细胞传递策略也是基于MSCs发展起来的再生医学的关键。因此,任何可以特异性的靶向传递干细胞到达目标感兴趣区域的技术将会突破经关节腔注射间充质干细胞疗法的瓶颈,减少并发症,增强修复效果,解决上述问题。目的本实验目的在于研究一种新型的细胞空间传递技术,利用外加磁场聚集SPIO标记的干细胞到达软骨缺损区域,增加局部干细胞密度,节约干细胞数量。方法1.体外SPIO标记hbMSCs的细胞生物学特性从骨髓中分离、培养hbMSCs,不同浓度SPIO(6.0μg/ml、9.0μg/ml、12.0μg/ml)与hbMSCs孵育24h。普鲁士蓝染色和透射电镜检查鉴定胞浆内铁粒子;胎盼蓝染色检测细胞存活;MTT法测定细胞生长曲线的变化。2.体外,磁力作用下SPIO标记的hbMSCs水平面上的聚集实验通过观察SPIO标记的hbMSCs在外加磁力干预下的分布模式,初步评价外加磁力聚集SPIO标记的hbMSCs到达特定靶区的可行性。将5×103/500ul SPIO标记的hbMSCs悬液接种在24孔板中心,添加1000ul培养基后吹打混匀。静置10分钟后,在孔板中心下方(M区:4×4mm2)安置一枚圆柱形铷铁硼强力永磁铁(直径:4mm,高:3mm,场强:0.20 T)。37°C继续培养24小时后移除磁体,光镜下(×100倍)计数每孔中心区域(M区)和周边区域(P区)的细胞数量。根据公式:细胞密度=细胞数量÷分布面积,分别求出M区细胞密度和P区细胞密度。采用单因素方差进行统计学分析。3.磁力作为物理趋化因素加强SPIO标记的hbMSCs在垂直方向上的迁移实验。采用Transwell双室培养系统评价细胞迁移实验。上室接种1×105/100ul SPIO标记的hbMSCs悬液,下室添加600ul的无血清培养基。实验组在下室底面中心的下方安置一枚圆柱形铷铁硼强力永磁铁(直径:4mm,高:3mm,场强:0.20 T,对照组不放置磁铁。37°C继续培养4小时后移除磁体,固定,结晶紫染色,随机10个高倍镜视野计数迁移的细胞数目。平均值采用单因素方差分析两组间的差异。4.体外三维立体空间,磁靶向移植SPIO标记的hbMSCs到达体外构建的关节软骨缺损模型hbMSCs与9.0μg/ml SPIO孵育24h,胰酶消化7×106 SPIO标记的hbMSCs悬浮于300uL培养基中。特制的铷铁硼永磁体(10cm×10cm×5cm,最高场强0.57T)用于产生磁场。收集新鲜的中度膝关节炎患者行全膝关节置换术时废弃的截骨块。用骨刀修剪成2cm×2cm的正方形骨软骨块,中心制作直径10mm,深3mm的全层软骨损伤。然后将骨软骨块用生物胶贴附在注满PBS溶液的培养瓶侧壁,模拟关节腔。在磁力作用下,用1ml空针缓慢将7×10~6 SPIO标记的hbMSCs悬液注射到培养瓶中,保持磁力作用90分钟。靶向移植前和移植后90分钟,3.0T MR T2加权自旋回波(SE T2 WI)序列扫描样本,对SPIO标记的hbMSCs进行成像示踪。分析信号强度(SI)改变,并与组织学评价对照。采用两独立样本t-检验,p< 0.01具有显著统计学差异。结果1.体外SPIO标记hbMSCs细胞生物学特性95%的SPIO标记hbMSCs普鲁士蓝染色呈阳性;透射电镜检查显示胞浆内含致密铁颗粒;胎盼蓝染色和MTT分析测定生长曲线证实不同标记浓度的SPIO标记对hbMSCs活性和增殖能力无影响(P>0.05)。2.SPIO标记的hbMSCs在外加磁力干预下的分布模式提示:SPIO标记的hbMSCs主要聚集在培养孔的中心区域,而培养孔的边缘区域很少有SPIO标记的hbMSCs分布。M区细胞密度为150个/mm~2,P区细胞密度为10个/mm~2。M区细胞密度为P区细胞密度的15倍,具有显著性统计学差异。3.实验组,磁力作为物理因子趋化SPIO标记的hbMSCs跨过聚碳酸酯膜上的小孔到达下室。对照组只有少量SPIO标记的hbMSCs迁移到达下室。两组具有显著性统计学差异,提示磁力增强SPIO标记的hbMSCs的迁移能力。4.体外三维立体空间,磁靶向移植SPIO标记的hbMSCs到达体外构建的关节软骨缺损模型①在外加磁场作用下,SPIO标记的hbMSCs悬液并不是垂直下落,其运动轨迹偏向磁力产生的方向,精确的引导到靶点。超过85%的SPIO标记hbMSCs到达软骨缺损中心。②磁靶向移植SPIO标记的hbMSCs 90分钟后,MR扫描影像提示软骨缺损区域显著的信号减弱(p <0.01)。信号强度衰减率(ΔSI)为78.7%。③H&E染色见大量的hbMSCs聚集在软骨缺损区域形成“细胞板层”样三维立体结构,平均厚度有25层hbMSCs。结论本实验是一种新型的干细胞空间传递技术,增加软骨损伤局部的hbMSCs密度。1.在体外,0.57T磁力可以精确地实现SPIO标记hbMSCs的空间靶向传递。2.临床高场强MR能够对SPIO标记hbMSCs进行超灵敏无创示踪。3.大量的hbMSCs聚集在软骨缺损区域,形成多层的“细胞板层”状三维立体组织工程结构,无需支架或者骨膜覆盖。