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目的:结直肠癌（colorectal cancer,CRC）在世界范围内的发病率与死亡率高居不下。治疗疗效较差是晚期CRC患者预后不良的关键因素。由于肿瘤细胞生长需要大量的血液供应,快速增殖的肿瘤组织内部常常供血不足,因此,恶性肿瘤的进展常常伴有肿瘤中心区域乏氧及肿瘤细胞代谢重编程的特征。已经有研究证实乏氧调节肿瘤细胞的糖酵解能力与其增殖、转移和化疗抵抗明显相关。奥沙利铂（Oxaliplatin,L-OHP）是晚期CRC患者化疗的一线用药,目前尚无研究揭示乏氧微环境调节的肿瘤细胞糖酵解与CRC细胞L-OHP治疗敏感性的关系。因此本研究拟深入探讨乏氧降低CRC细胞对L-OHP治疗敏感性的作用机制,以寻找新的预测治疗疗效标志物和提高药物治疗敏感性的新策略,为临床决策提供新的理论基础与依据。研究方法:1.采用蛋白免疫印迹技术鉴定乏氧相关蛋白标志物的表达以明确氯化钴（cobalt chloride,Co Cl2）对乏氧状态的诱导作用;2.采用MTS细胞活力测定检测试剂盒、克隆形成实验、流式细胞术（Annexin V/PI双染法）和蛋白免疫印迹技术检测常氧及乏氧条件下肿瘤细胞的细胞活力及增殖、凋亡情况,以探究乏氧对肿瘤细胞的L-OHP敏感性的影响;3.采用乳酸生成实验、ATP生成实验检测L-OHP处理时,常氧及乏氧肿瘤细胞糖酵解水平的差异;4.采用实时荧光定量PCR实验、蛋白免疫印迹技术检测常氧与乏氧条件下,差异表达的糖酵解酶。小干扰RNA（si RNA）转染实验与生信网站预测蛋白结合位点,验证乏氧对差异表达的糖酵解酶的调控作用,以明确乏氧对糖酵解的具体调控机制;5.统计学分析:每个实验结果均进行3次重复验证,采用SPSS 19.0软件分析数据。P＜0.05有统计学差异。结果:1.乏氧化学诱导剂Co Cl2能够降低CRC细胞对L-OHP的敏感性以及增强肿瘤细胞的糖酵解能力。蛋白免疫印迹实验表明Co Cl2处理后乏氧诱导因子HIF-1α的表达升高,证明了Co Cl2对CRC细胞乏氧状态的诱导作用。MTS细胞增殖实验和克隆形成实验表明L-OHP刺激下的乏氧肿瘤细胞的细胞活力和集落形成数目均高于常氧肿瘤细胞（P＜0.05）。使用流式细胞术（Annexin V/PI双染法）检测早期与晚期凋亡细胞发现L-OHP刺激的乏氧肿瘤细胞的凋亡百分比（DLD1细胞P＜0.01、Lo Vo细胞P＜0.05）明显低于常氧肿瘤细胞。使用蛋白免疫印迹技术实验检测凋亡相关标志物表达水平发现L-OHP刺激的乏氧肿瘤细胞内凋亡蛋白Bax的表达低于常氧肿瘤细胞、而抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-x L的表达明显高于常氧肿瘤细胞。以上实验结果均证明乏氧能够降低肿瘤细胞对L-OHP的敏感性。使用乳酸生成试剂盒及ATP生成试剂盒进行检测时发现L-OHP刺激的乏氧肿瘤细胞的乳酸生成和ATP生成均高于常氧细胞,证明乏氧增强了肿瘤细胞的糖酵解能力。2.乏氧通过增强肿瘤细胞的糖酵解能力降低L-OHP的敏感性。2-脱氧-D-葡萄糖（2-Deoxy-D-glucose,2-DG）是一种公认的糖酵解抑制剂。乳酸生成和ATP生成实验表明L-OHP刺激的乏氧肿瘤细胞在2-DG处理后,乳酸产量与ATP生成量下降。MTS实验和克隆形成实验表明2-DG能够使L-OHP刺激的乏氧肿瘤细胞细胞活力和集落形成数目明显降低。流式细胞术（Annexin V/PI双染法）表明2-DG能够使L-OHP刺激的乏氧肿瘤细胞凋亡细胞百分比明显增高。蛋白免疫印迹实验结果表明,2-DG能够使L-OHP刺激的乏氧肿瘤细胞的Bax表达升高、Bcl-2、Bcl-x L表达降低。综上所述,抑制乏氧肿瘤细胞的糖酵解能够明显降低肿瘤细胞增殖并且促进其凋亡,证明乏氧可能是通过介导肿瘤细胞糖酵解降低对L-OHP的敏感性。3.乏氧通过调控ALDOC表达增强肿瘤细胞的糖酵解从而降低L-OHP敏感性。使用PCR实验与蛋白免疫印迹实验筛选L-OHP刺激的乏氧肿瘤细胞与常氧细胞内糖酵解相关关键转运体和关键酶的表达差异,结果表明L-OHP刺激的乏氧肿瘤细胞内醛缩酶C（aldolase C,ALDOC）m RNA及ALDOC蛋白的表达上调。L-OHP刺激的乏氧肿瘤细胞接受si HIF-1α处理时,ALDOC m RNA及ALDOC蛋白表达下调,证明了乏氧对ALDOC的表达具有正向调控作用。乳酸生成和ATP生成实验表明,L-OHP刺激的乏氧肿瘤细胞接受si ALDOC转染处理时,乳酸及ATP的生成水平均显著降低。MTS实验和克隆形成实验表明,L-OHP刺激的乏氧肿瘤细胞接受si ALDOC转染处理时,细胞活力与集落形成数目显著下降。流式细胞术（Annexin V/PI双染法）、蛋白免疫印迹实验表明L-OHP刺激的乏氧肿瘤细胞接受si ALDOC转染处理时,凋亡细胞百分比增多及凋亡蛋白表达升高。证明乏氧可能是通过调控ALDOC增强了糖酵解从而降低肿瘤细胞对L-OHP的敏感性。4.HIF-1α/BMAL1/ALDOC的调控机制。PCR实验与蛋白免疫印迹实验结果表明,L-OHP刺激的乏氧肿瘤细胞内BMAL1 m RNA及BMAL1蛋白的表达水平明显高于常氧细胞。UCSC及Jaspar网站预测结果显示BMAL1的启动子区存在着HIF-1α的结合位点。L-OHP刺激的乏氧肿瘤细胞在si HIF-1α转染处理时,BMAL1 m RNA及BMAL1蛋白表达下调,证明了乏氧对BMAL1的表达具有正向调控作用。通过UCSC及Jaspar网站进行预测,结果表明BMAL1与ALDOC的启动子区也存在着结合位点。L-OHP刺激的乏氧肿瘤细胞在si BMAL1转染处理时,ALDOC m RNA及ALDOC蛋白表达下调,证明了乏氧情况下BMAL1对ALDOC存在调控作用。以上实验证明HIF-1α可以通过上调BMAL1进而发挥对ALDOC的正向调控作用。结论:1.乏氧通过增强肿瘤细胞的糖酵解降低肿瘤细胞对L-OHP的敏感性。2.乏氧通过HIF-1α/BMAL1/ALDOC轴增强了肿瘤细胞糖酵解从而降低了对L-OHP敏感性。