【摘 要】
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研究背景与目的:脑胶质瘤是中枢神经系统最常见的原发性恶性肿瘤之一,具有易复发、预后差等特点。据文献报导,肿瘤细胞普遍具有的免疫抑制作用为肿瘤复发提供了有利条件。碳酸酐酶-9（Carbonic anhydrase 9,CA9）是一种跨膜蛋白且在胶质瘤患者脑组织中高表达,与肿瘤的免疫抑制密切相关。4-[3’-（3",5"-dimethylphenyl）ureido]phenyl sulfamate（S
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研究背景与目的:脑胶质瘤是中枢神经系统最常见的原发性恶性肿瘤之一,具有易复发、预后差等特点。据文献报导,肿瘤细胞普遍具有的免疫抑制作用为肿瘤复发提供了有利条件。碳酸酐酶-9（Carbonic anhydrase 9,CA9）是一种跨膜蛋白且在胶质瘤患者脑组织中高表达,与肿瘤的免疫抑制密切相关。4-[3’-（3",5"-dimethylphenyl）ureido]phenyl sulfamate（S4）作为CA9的新型高效抑制剂已证实在乳腺癌、结直肠癌、肺癌等肿瘤细胞中发挥抑制增殖或诱导死亡的作用,但尚不清楚这些过程是否干扰免疫抑制。降低肿瘤细胞免疫抑制作用的常用手段之一是诱导肿瘤细胞发生免疫性细胞死亡（Immunogenic cell death,ICD）。ICD是一种将能够引起免疫反应的蛋白分子暴露于细胞表面的特殊的调节性死亡方式,这种细胞死亡方式使免疫系统能更高效的识别肿瘤细胞,增强药物与免疫系统的共同作用,从而提高机体对肿瘤的杀伤效力。ICD的主要特征有细胞膜钙网蛋白（Calreticulin,CRT）的暴露、高迁移率族蛋白B1（High-mobility group box 1,HMGB1）与热休克蛋白（Heat shock protein,HSP）70/90的释放等。因此,本研究旨在探讨S4诱导的胶质瘤细胞死亡是否与ICD相关,并探究其具体的分子机制,为胶质瘤新型治疗药物的选择与研发提供理论基础。方法:（1）采用不同浓度的S4处理胶质瘤细胞,通过CCK-8实验、平板克隆形成实验、免疫荧光实验检测S4对胶质瘤细胞活力与增殖的作用;（2）应用流式细胞术、PI染色实验检测S4是否诱导胶质瘤细胞死亡,蛋白免疫印迹实验（Western blotting,WB）检测凋亡、自噬、坏死相关蛋白;（3）S4分别处理LN229、U87MG细胞,WB实验检测浓缩细胞上清液HMGB1、HSP70/90的释放;（4）S4分别处理LN229、U87MG细胞,免疫荧光实验检测胶质瘤细胞CRT暴露情况;（5）S4与自噬抑制剂Chloroquine（CQ）、凋亡抑制剂Z-VAD-FMK、坏死抑制剂Necrostain-1单独或共同处理LN229、U87MG细胞,检测CRT暴露和HMGB1、HSP70/90释放情况;（6）收集经S4处理后的LN229细胞样品进行转录组测序,根据测序结果检测内质网应激通路相关蛋白的表达;（7）S4与PERK通路抑制剂ISRIB与GSK2606414、IRE1α-XBP1（s）通路抑制剂4μ8C单独或共同处理LN229、U87MG细胞,检测HMGB1、HSP70/90释放与CRT暴露的情况,探究S4诱导的免疫性细胞死亡的具体分子机制。结果:（1）CCK-8实验结果与3D成球培养实验结果显示:S4抑制胶质瘤细胞的活力和成球能力;（2）平板克隆实验结果表明:S4抑制胶质瘤细胞集落形成能力,免疫荧光实验结果表明S4抑制胶质瘤细胞Ki67的表达;（3）流式细胞术实验与PI荧光染色实验结果显示:S4诱导LN229、U87MG细胞死亡;（4）WB实验结果显示:S4促进胶质瘤LN229、U87MG细胞凋亡相关蛋白Cleaved-PARP与自噬相关蛋白LC3-Ⅱ的表达;（5）免疫荧光实验与WB实验结果证实:与对照组相比,S4显著诱导LN229、U87MG细胞CRT暴露在细胞膜表面及HMGB1、HSP70/90的释放;（6）免疫荧光实验与WB实验结果显示:S4诱导胶质瘤细胞CRT暴露及HMGB1、HSP70/90的释放可被自噬抑制剂CQ和凋亡抑制剂Z-VAD-FMK逆转,且自噬抑制剂为主要逆转因素;（7）转录组测序结果与WB实验结果提示:S4激活内质网应激通路,IRE1α-XBP1（s）通路相关蛋白和PERK通路相关蛋白均表达升高;（8）WB实验与免疫荧光实验结果显示:内质网应激PERK通路抑制剂GSK2606414与ISRIB均可显著逆转S4诱导的CRT暴露与HMGB1、HSP70/90的释放。结论:S4抑制胶质瘤细胞活力、增殖与成球能力,诱导凋亡和自噬,且可能通过激活内质网应激PERK通路诱导胶质瘤细胞自噬,进而发生免疫性细胞死亡。
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