研究背景雷公藤内脂醇（TP）是一种从传统中草药雷公藤中提取的环氧二萜内酯化合物,具有较强的抗肿瘤、免疫抑制和抗炎作用,但由于其溶解度较低和毒性限制了其在临床中的应用。长期使用可导致肝肿大、肝损伤、ALT、AST升高等不良事件。因此TP的结构修饰与开发新的TP靶向给药系统十分必要。TP衍生物的涌现加深了人们对于TP各个基团功能及其参与信号通路的理解。TP发挥抗肿瘤作用有多种方式:诱导肿瘤的凋亡与自噬;抑制上皮向间充质转化减少肿瘤的转移与侵袭;抑制细胞转录。TP在多种癌症中表现出临床前抗肿瘤活性,包括乳腺癌,卵巢癌,肺癌,前列腺癌,神经母细胞瘤,以及多种胃肠道癌症。根据世界卫生组织国际癌症研究机构（IARC）2020年发布的数据显示,在全球范围乳腺癌新增人数达226万,乳腺癌已经成为发病数最高的癌症。在大多数实体恶性肿瘤中,TAM占免疫细胞浸润的最大比例,为抑制其促肿瘤效应针对性消耗TAM成为癌症治疗手段。尽管如此,TAMs的表型和功能仍具有可塑性。也可以通过吞噬肿瘤细胞和招募细胞毒性T细胞激活抗肿瘤免疫作为效应细胞。因此,改变TAM表型至抗肿瘤巨噬细胞优于直接消耗TAM,改变TAM极化方向成为抗肿瘤治疗中重要的策略,本课题的第一部分的目的是探究TP对TAM极化的影响,以调节免疫微环境的方式发挥抗肿瘤效应。此外,现已经有多种方式修饰TP加强靶向性,如结合糖,短肽,寡核苷酸,抗体以及纳米颗粒包封。纳米载体的药物递送系统向目标组织定向输送药物,改变药物的药代动力学和毒性特征,纳米载体在改善药物的稳定性和细胞摄取方面具有很大潜力。基于此,本课题第二部分的目的是探究TP的靶向递送系统,提高TP在抗肿瘤治疗中的疗效,降低毒性。研究方法第一部分:1.BMDM经10 ng/m L TP处理后与4T1共培养,诱导形成TAM。通过RT-q PCR,ELISA,流式细胞术分析TP对TAM促肿瘤基因表达的影响。2.使用IL-4和TP诱导BMDM向M2极化,分析TP对M2标志基因表达的影响。3.sh RNA敲减i BMDM中的PPARγ,通过标志分子表达情况,分析PPARγ是否在TP调控巨噬细胞极化中的作用。4.流式细胞术分析0.6 mg/kg TP治疗的4T1原位接种肿瘤免疫细胞浸润情况,在体内对TP影响TAM极化的能力进行评估。第二部分:1.使用薄膜分散法制备TP脂质体,并用N3-HA修饰脂质体,通过Zeta电位仪,粒径检测仪,傅里叶变换红外光谱仪,透射电镜,HPLC对脂质体进行表征。2.使用使用30-120μg/m L TP,TP脂质体（TPLP）以及HA修饰的脂质体（TPLP-HA）处理MCF-7,4T1,Hep G2和239T细胞,MTT法评估脂质体的减毒作用。3.用流式细胞术检测脂质体诱导4T1凋亡的能力;使用香豆素6（C6）替换脂质体中的TP评估脂质体内化水平。4.使用脂质体治疗4T1（CD44+）小鼠乳腺癌模型与MCF-7人乳腺癌裸鼠模型中的肿瘤,测量肿瘤质量与体积,评估脂质体体内抗肿瘤效;检测上述模型中血清ALT,AST和BUN水平,及体重、肝、脾重量,评估脂质体在治疗过程中对小鼠的全身毒性。5.使用高剂量TP及其脂质体处理小鼠,计算LD50,LD95分析脂质体对TP急性毒性的影响。研究结果第一部分:本研究发现TP能够显著抑制TAM中促肿瘤基因:CD206,Arg1,IL-10,VEGFA的表达。精氨酸酶活性,IL-10释放水平以及细胞表面CD206分子都被TP下调。在BMDM M2极化模型中,TP也能显著下调M2的标志基因,表明TP能够抑制巨噬细胞M2极化。TP能抑制BMDM中PPARγ表达量。在PPARγ敲减的i BMDM中TP无法下调IL-4诱导的Arg1,CD206基因表达,精氨酸酶活性也有相同趋势,表明TP对巨噬细胞极化的调控是由PPARγ介导的。在小鼠乳腺癌模型中,TP不改变TAM浸润比例,但M1/M2是对照组两倍,TP对T细胞的浸润与肿瘤大小无明显影响。第二部分:通过薄膜分散法成功制备粒径为62nm,zeta电位为+28m V的阳离子脂质体TPLP,叠氮化物红外吸收峰的消失,粒径及zeta电位的变化表明,成功制备均匀球状脂质体TPLP-HA。使用空载脂质体不影响细胞增殖,表明脂质体本身对细胞无毒性。使用TP及其脂质体处理细胞时,TP脂质体对细胞的抑制率均低于单独使用的TP,显示了脂质体对TP的减毒作用。TP诱导4T1凋亡的能力强于TPLP-HA,二者均强于TPLP,在120μg/m L浓度下TP和TPLP-HA诱导凋亡的能力相近。流式结果显示C6-LP-HA在细胞中的荧光强度高于C6-LP。在两个小鼠乳腺癌模型中,TPLP-HA与TP能显著抑制肿瘤生长,TPLP无抗肿瘤效应。并且TP及其脂质体对MCF-7在体肿瘤的抑制能力强于4T1。TP能够上调小鼠细胞毒性指标,降低体重,TP脂质体则会抑制上述现象。急性毒性实验中TP的LD50比TPLP-HA低2.36倍,TPLP-HA的LD95比TP提高了2.34倍。研究结论第一部分:TP抑制体外TAM与（IL-4）BMDM的M2极化,TP通过下调PPARγ表达量发挥抑制作用。TP能够抑制乳腺癌荷瘤小鼠中TAM向M2极化。我们的研究发现TP与TAM的M2极化存在直接关系,这为促进M2向M1复极化和肿瘤免疫微环境重建提供了策略。第二部分:TPLP-HA对细胞系的细胞毒作用,以及体内实验中的肝肾毒性低于TP,TPLP-HA和TP的早期凋亡诱导能力相似。体内TPLP-HA对乳腺癌具有显著的抗肿瘤能力,特别是在MCF-7异种移植模型中。HA修饰提高了TPLP抗肿瘤效应。在急性毒性试验中,与单独使用TP相比,TPLP-HA的LD50和LD95显着增加。综上所述,本研究提供了改善TP体内药物输送方式的实例,通过脂质体的包封与HA修饰成功实现了乳腺癌的靶向治疗,这将有助于TP治疗乳腺癌的临床试验。