第一部分宿主Langerin在鼠疫耶尔森氏菌致病机制中作用的研究　　【背景与目的】　　鼠疫耶尔森氏菌是鼠疫的致病菌，是一种革兰氏阴性菌。鼠疫菌主要经由跳蚤叮咬而传播，它通过皮肤进入宿主体内后，快速传播至淋巴结，造成淋巴结坏死或进入血液向全身播散（败血症鼠疫），或造成肺部感染（肺鼠疫），引起的鼠疫病情发展快，死亡率高。但鼠疫菌在宿主体内快速传播至淋巴结的具体机制尚未研究清楚。　　鼠疫菌克服宿主皮肤屏障后，遇到朗格汉斯细胞等抗原提呈细胞，这些细胞将鼠疫菌捕获并运送至淋巴结。朗格汉斯细胞是表皮中未成熟的树突状细胞，特异性表达一种 C型凝集素受体——Langerin，已有研究表明 Langerin能与多种病原微生物表面的糖分子相结合。鼠疫菌是一种粗糙型菌株，即在其菌体外表面不表达O抗原，核心寡糖呈自然裸露状态。我们前期的研究结果表明，某些粗糙型革兰氏阴性菌的核心寡糖可以与C型凝集素受体结合。　　在本研究中，我们观察鼠疫菌与朗格汉斯细胞的相互作用，探讨 C型凝集素受体Langerin与核心寡糖的结合在鼠疫菌的侵袭和传播中的作用。　　【方法】　　1.检测粗糙型、光滑型和深度粗糙型鼠疫菌对人朗格汉斯细胞的侵袭　　（1）用庆大霉素保护法检测鼠疫菌 KIM10-（粗糙型，核心寡糖自然裸露）、KIM10--O+（光滑型，核心寡糖被O抗原覆盖）以及KIM10--core-（深度粗糙型，核心寡糖缺失突变）对人朗格汉斯细胞的侵袭能力（此方法检测的是侵入人朗格汉斯细胞且在胞内存活的鼠疫菌）。　　（2）用CFDA-SE标记这三种鼠疫菌，加至人朗格汉斯细胞中相互作用2 h，用台盼蓝淬灭细胞外荧光，用流式细胞术检测荧光强度（此方法检测的是侵入人朗格汉斯细胞内的所有鼠疫菌）。　　2.检测粗糙型、光滑型和深度粗糙型鼠疫菌对CHO-Langerin稳转细胞的侵袭　　将Langerin基因和DEC-205基因分别稳定转染到CHO细胞，用庆大霉素保护法检测鼠疫菌KIM10-（粗糙型）、KIM10--O+（光滑型）以及KIM10--core-（深度粗糙型）对CHO-Langerin稳转细胞的侵袭。同时检测这三种细菌对CHO-NEO、CHO-DEC-205稳转细胞的侵袭，作为对CHO-Langerin稳转细胞侵袭的对照。　　3.检测核心寡糖突变株对CHO-Langerin稳转细胞的侵袭　　为了寻找在核心寡糖-Langerin结合中起关键作用的糖分子，我们用核心寡糖不同长度缺失的大肠杆菌突变株（由于目前没有鼠疫菌核心寡糖的突变株），与 CHO-Langerin稳转细胞相互作用，找到介导此作用的糖分子。　　4.侵袭抑制实验　　（1）检测脐带血来源的人朗格汉斯细胞（hcbLCs）和表皮来源的人朗格汉斯细胞（hLCs）表面Langerin和DC-SIGN表达水平，用抗Langerin（CD207）抗体或抗DC-SIGN（CD209）抗体与人朗格汉斯细胞作用20 min，再加入鼠疫菌KIM10-与之作用，用庆大霉素保护法检测细菌的侵袭。　　（2）将CHO-Langerin稳转细胞与Langerin抗体、Langerin纯化蛋白、不同的寡糖、单糖分别作用20 min，再加入鼠疫菌KIM10-与之作用，用庆大霉素保护法检测细菌的侵袭。　　5.检测鼠疫菌与Langerin纯化蛋白以及DC-SIGN样分子的结合　　分别用FITC标记的Langerin纯化蛋白以及DC-SIGN样分子Mermaid与鼠疫菌KIM10-（粗糙型）或KIM10--O+（光滑型）相互作用，洗去未结合的蛋白后，用流式细胞仪检测荧光强度。　　6.体内研究　　（1）用鼠疫菌KIM6+（粗糙型，核心寡糖自然裸露）或KIM6+-O+（光滑型，核心寡糖被O抗原覆盖）经皮感染小鼠，24 h后处死小鼠，分离腹股沟淋巴结，比较这两组鼠疫菌在体内传播的能力。　　（2）用鼠疫菌弱毒株 Y. pestis1418（粗糙型，核心寡糖自然裸露）或 Y. pestis1418-O+（光滑型，核心寡糖被O抗原覆盖）经皮感染小鼠，比较这两组鼠疫菌对小鼠存活的影响。　　【结果】　　1.核心寡糖介导鼠疫菌对人朗格汉斯细胞的侵袭　　鼠疫菌KIM10-（粗糙型）对人朗格汉斯细胞的侵袭能力显著高于KIM10--O+（光滑型）以及 KIM10--core-（深度粗糙型），此结果说明核心寡糖介导鼠疫菌对人朗格汉斯细胞的侵袭。　　2.核心寡糖与Langerin的结合介导鼠疫菌对宿主细胞的侵袭　　鼠疫菌KIM10-（粗糙型）对CHO-Langerin稳转细胞的侵袭能力显著高于KIM10--O+（光滑型）以及 KIM10--core-（深度粗糙型）的侵袭能力，且显著高于对CHO-NEO、CHO-DEC-205稳转细胞的侵袭能力。这些结果说明，核心寡糖与Langerin的结合介导鼠疫菌对宿主细胞的侵袭，Langerin是鼠疫菌的受体。　　3.在核心寡糖-Langerin结合中起关键作用的糖分子　　随着核心寡糖长度的缩短，大肠杆菌核心寡糖突变株侵袭CHO-Langerin稳转细胞的能力下降，说明在核心寡糖-Langerin结合中起关键作用的糖分子位于核心寡糖的外核（outer core）中。　　4. Langerin抗体、Langerin纯化蛋白以及某些寡糖分子对鼠疫菌与人朗格汉斯细胞及CHO-Langerin稳转细胞的结合的抑制作用　　加入Langerin抗体后，鼠疫菌KIM10-对人朗格汉斯细胞（hcbLCs和hLCs）的侵袭能力显著下降。加入Langerin抗体、Langerin纯化蛋白以及某些寡糖分子后，鼠疫菌对CHO-Langerin稳转细胞的侵袭能力也显著下降。这些结果再次验证了Langerin是鼠疫菌的受体，核心寡糖是鼠疫菌表面的配体，核心寡糖与 Langerin的结合对鼠疫菌侵袭宿主细胞起重要作用。　　5.鼠疫菌与Langerin纯化蛋白以及Mermaid的结合　　鼠疫菌KIM10-（粗糙型）与Langerin纯化蛋白以及DC-SIGN样分子Mermaid的结合能力显著高于KIM10-O+（光滑型），此结果再次证明Langerin是鼠疫菌的受体，且核心寡糖是Langerin的配体。　　6.核心寡糖-Langerin相互作用对鼠疫菌在小鼠体内的传播及对小鼠存活的影响　　在经皮感染的小鼠模型中，鼠疫菌KIM6+-O+（光滑型）传播至淋巴结的能力显著低于KIM6+（粗糙型）；感染鼠疫菌Y. pestis1418-O+（光滑型）小鼠的存活时间显著长于感染Y. pestis1418（粗糙型）的小鼠。这些结果说明核心寡糖-Langerin相互作用促进鼠疫菌传播至淋巴结的能力，影响小鼠的存活。　　【结论】　　本研究证实 C型凝集素受体 Langerin是朗格汉斯细胞表面鼠疫菌的受体，Langeirn与鼠疫菌表面核心寡糖的结合介导鼠疫菌对朗格汉斯细胞的侵袭，促进鼠疫菌在体内的传播。　　第二部分人DC-SIGN和小鼠SIGNR1在粗糙型假结核耶尔森氏菌致病机制中作用的研究　　【背景与目的】　　假结核耶尔森氏菌是一种食源性革兰氏阴性致病菌，在外界环境中广泛分布，常常引起回肠炎和肠系膜淋巴结炎。假结核菌进入消化道后，穿过肠黏膜进入淋巴结，引起淋巴结和回肠末端肿大，或播散至肝、脾等远处器官，但此过程的具体机制尚未研究清楚。　　鼠疫菌是鼠疫的致病菌，具有极强的毒力，由假结核菌进化而来。在进化的过程中，鼠疫菌丢失了脂多糖结构最外侧的O抗原，因此核心寡糖自然暴露。假结核菌在26℃（外界环境温度）条件下表达O抗原（称为光滑型），而在37℃培养条件下，它的O抗原的表达受到抑制，核心寡糖暴露出来（称为粗糙型）。核心寡糖的自然暴露是鼠疫菌和假结核菌一个重要的差别，我们认为它可能与细菌毒力的增加有关。　　DC-SIGN是表达于树突状细胞表面的一种C型凝集素受体，能与多种病原微生物表面的糖分子结合。SIGNR1是小鼠表达的DC-SIGN的同源体之一。我们的前期研究表明，粗糙型大肠杆菌、淋病奈瑟氏菌等革兰氏阴性菌的核心寡糖是 C型凝集素受体DC-SIGN的配体。　　在本研究中，我们探讨假结核菌核心寡糖与DC-SIGN以及SIGNR1的相互作用，以及它对假结核菌在体内传播的影响。　　【方法】　　1.体外实验检测光滑型和粗糙型假结核菌对人树突状细胞（hDCs）的侵袭能力　　（1）用庆大霉素保护法检测培养于26℃（光滑型，核心寡糖被O抗原覆盖）或37℃（粗糙型，O抗原表达被抑制，核心寡糖暴露）下的假结核菌对hDCs的侵袭能力。此方法检测的是侵入hDCs且在胞内存活的假结核菌。　　（2）用CFDA-SE标记这两种假结核菌，加至hDCs中使其相互作用，用台盼蓝淬灭细胞外的荧光，用流式细胞术检测。此方法检测的是侵入hDCs内的所有假结核菌。　　2.体外实验检测光滑型和粗糙型假结核菌对HeLa-NEO以及HeLa-DC-SIGN细胞的侵袭能力　　分别将 neo、DC-SIGN基因稳转到 HeLa细胞，用庆大霉素保护法检测培养于26℃（光滑型）或37℃（粗糙型）下的假结核菌 Y1对HeLa-NEO以及 HeLa-DC-SIGN稳转细胞的侵袭能力。　　3.体外实验检测光滑型和粗糙型假结核菌对hDCs、人肺泡巨噬细胞和HeLa-DC-SIGN细胞的侵袭能力　　用庆大霉素保护法检测光滑型假结核菌（26-PB1）以及粗糙型假结核菌（26-PB1?wb、37- PB1?wb和37-PB1）对人DCs、人肺泡巨噬细胞以及HeLa-DC-SIGN细胞的侵袭能力。　　4.体外实验检测光滑型和粗糙型假结核菌对小鼠腹腔巨噬细胞以及 CHO-SIGNR1细胞的侵袭　　（1）用庆大霉素保护法和流式细胞术检测光滑型假结核菌（26-Y1和26-PB1）以及粗糙型假结核菌（37-Y1和26-PB1?wb）对小鼠腹腔巨噬细胞的侵袭。　　（2）用流式细胞术检测 CHO-SIGNR1细胞 SIGNR1的表达，用庆大霉素保护法比较粗糙型假结核菌PB1?wb对CHO-NEO和CHO-SIGNR1细胞的侵袭。　　5.体内实验检测光滑型和粗糙型假结核菌对小鼠腹腔巨噬细胞的侵袭。　　将光滑型假结核菌PB1和粗糙型PB1?wb注射至小鼠腹腔，作用1.5 h后，处死小鼠，收集腹腔巨噬细胞，用庆大霉素保护法比较两组细菌对小鼠腹腔巨噬细胞的侵袭。　　6.体内实验比较 O抗原表达受温度调控的和持续性表达 O抗原的假结核菌在小鼠体内的传播　　（1）将O抗原表达受温度调控的假结核菌（Y1-pBR322）和持续性表达O抗原的假结核菌（Y1-pAY100.1）灌胃至小鼠体内，作用3天之后，用平皿计数法、Real-time PCR法以及小动物活体成像法比较两组小鼠脾、肝、肠系膜淋巴结中的细菌数量；　　（2）将带有mCherry荧光标记的假结核菌Y1 pBR322和Y1 pAY100.1注入小鼠结扎的小肠肠腔中，作用30 min后，取肠组织做冰冻切片，用免疫荧光法观察细菌对肠壁细胞的侵袭。　　【结果】　　1.假结核菌核心寡糖的暴露增强其侵袭hDCs的能力　　培养于37℃条件下的假结核菌（37-Y1，粗糙型）对hDCs的侵袭能力显著高于培养于26℃的假结核菌（26-Y1，光滑型）。此结果说明，暴露核心寡糖增强了假结核菌侵袭hDCs的能力。　　2. DC-SIGN是粗糙型假结核菌的受体　　培养于37℃条件下的假结核菌（37-Y1，粗糙型）对HeLa-DC-SIGN细胞的侵袭能力显著高于对HeLa-NEO细胞的侵袭能力。此结果说明，DC-SIGN是粗糙型假结核菌的受体。　　3.核心寡糖与DC-SIGN的结合介导粗糙型假结核菌对人DCs、人肺泡巨噬细胞以及HeLa-DC-SIGN细胞的侵袭　　粗糙型假结核菌（26-PB1?wb、37-PB1?wb、37-PB1）对人DCs、人肺泡巨噬细胞以及 HeLa-DC-SIGN细胞的侵袭能力显著高于光滑型假结核菌（26-PB1）。同时，粗糙型假结核菌（26-PB1?wb、37-PB1?wb、37-PB1）对HeLa-DC-SIGN细胞的侵袭能力显著高于对HeLa-NEO细胞的侵袭能力。这些结果说明，核心寡糖与DC-SIGN的结合促进粗糙型假结核菌对宿主细胞的侵袭，再次证明了DC-SIGN是粗糙型假结核菌的受体。　　4.核心寡糖与 SIGNR1的结合介导粗糙型假结核菌对小鼠腹腔巨噬细胞和CHO-SIGNR1细胞的侵袭　　粗糙型假结核菌（37-Y1和PB1?wb）对小鼠腹腔巨噬细胞的侵袭显著高于光滑型假结核菌（26-Y1和PB1）；粗糙型假结核菌（PB1?wb）对CHO-SIGNR1细胞的侵袭能力显著高于对CHO-NEO细胞的侵袭能力。这些结果说明，核心寡糖与SIGNR1的结合介导粗糙型假结核菌对小鼠腹腔巨噬细胞的侵袭，再次证明了 SIGNR1是假结核菌核心寡糖的受体。　　5.小鼠体内核心寡糖与SIGNR1的结合介导粗糙型假结核菌对腹腔巨噬细胞的侵袭　　粗糙型假结核菌在小鼠体内对腹腔巨噬细胞的侵袭能力显著高于光滑型假结核菌。此结果说明，在小鼠体内核心寡糖与 SIGNR1的结合介导粗糙型假结核菌对腹腔巨噬细胞的侵袭。　　6.光滑型假结核菌在小鼠体内传播的能力下降　　持续性表达O抗原的假结核菌（光滑型）在小鼠体内传播至脾、肝、肠系膜淋巴结的能力显著低于O抗原表达受温度调控的假结核菌（在体内O抗原表达受抑制，粗糙型）的侵袭能力，但它们对肠壁细胞的侵袭能力无明显差别。此结果说明，在假结核菌致病过程中的某些阶段，核心寡糖的暴露对细菌的传播具有重要意义。　　【结论】　　人DCs细胞表面的DC-SIGN和小鼠巨噬细胞表面的SIGNR1是粗糙型假结核菌核心寡糖的受体，核心寡糖与DC-SIGN以及SIGNR1的结合可能在假结核菌感染的过程中促进细菌的传播。