研究背景:血管性血友病因子(von Willebrand factor,VWF)主要是由血管内皮细胞和巨核细胞产生的一种超大分子量的多聚体糖蛋白,细胞内合成的VWF可以立即持续地分泌到细胞外,也可以超大型VWF分子(ultra-large VWF,UL-VWF)的形式储存于血小板的α颗粒和内皮细胞的Weibel-Palade小体中。当血管壁受损或受到某些炎症因子刺激时,VWF被释放到血液循环中,一方面通过其A3区与血管内皮下Ⅰ型、Ⅲ型胶原的α-1链结合;另一方面通过A1区与血小板糖蛋白Ibα(glycoprotein Ibα,GPIbα)结合,成为联系血小板和内皮基质的桥梁,在机体止血和血栓的形成过程中发挥着重要的作用。近年来,许多研究表明VWF除了在止血中起着关键作用,在机体炎症的发生、组织的损伤和修复、血管新生、免疫调节以及癌症转移等众多病理生理过程中也发挥着重要的作用。关于VWF在肿瘤转移中的作用,有研究猜测其可能通过参与肿瘤细胞黏附至血小板和内皮表面来促进肿瘤细胞的外渗和转移。而血小板在肿瘤转移中的作用已被广泛研究,肿瘤细胞通过诱导血小板的聚集并形成杂聚体以保护其逃脱机体的免疫监视,且形成的肿瘤细胞-血小板杂聚体可以与血管内皮结合而促进肿瘤细胞的转移。因此,作为促进血小板和内皮细胞相互作用的主要参与者,VWF本身极有可能在促进肿瘤细胞转移的过程中发挥作用。长期以来,国内外大部分研究表明肿瘤患者的血浆VWF水平明显升高,且该水平与肿瘤的恶性程度呈正相关;另一部分研究却认为VWF可能对肿瘤细胞发挥促凋亡作用,且可以作为一种抗肿瘤转移蛋白。产生此分歧的原因可能是这些研究主要针对的是内皮细胞和血小板来源的VWF对肿瘤细胞转移的作用。而最新研究发现,VWF在骨肉瘤细胞、神经胶质瘤细胞以及肝癌细胞等少数非内皮来源的肿瘤细胞中也存在一定量的表达,且以肿瘤细胞来源的VWF作为潜在抗肿瘤转移靶点的研究也受到了越来越多的关注。骨肉瘤是最常见的高度转移性恶性骨肿瘤,肺转移是骨肉瘤患者死亡的最常见原因。随着近年来医疗技术的进步,骨肉瘤患者的长期生存率明显提高。然而一旦发生转移,患者的5年生存率仅约为20%。因此,探索用于抑制骨肉瘤转移的新型治疗靶点成为国内外近年来研究的热点。目的:本研究旨在探索骨肉瘤患者原位和转移的肿瘤组织中VWF表达水平的差异,比较骨肉瘤细胞与内皮细胞中VWF表达模式的差异;初步阐明骨肉瘤细胞来源的VWF在介导与血小板的黏附以及在骨肉瘤细胞的迁移和侵袭过程中的作用和机制。方法:(1)收集就诊于苏州大学附属第一医院的66例骨肉瘤患者的血浆标本,以及在门诊体检正常的60例正常志愿者血浆作为对照组(Control,CTL);用酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测骨肉瘤患者和CTL组血浆中VWF的表达水平;(2)收集就诊于苏州大学附属第一医院的12例骨肉瘤患者的病理组织标本,将石蜡包埋好的病理切片进行苏木素-伊红染色(Hematoxylin-Eosin staining,HE)和免疫组织化学染色(Immunohistochemical analyses,IHC),运用小鼠抗人VWF单克隆抗体SZ34,比较VWF在不同骨肉瘤病理标本中的表达水平;(3)利用蛋白质免疫印迹实验(Westemblot,Wb)和免疫荧光染色检测人骨肉瘤细胞系SAOS2中VWF的表达;运用多聚体电泳技术研究SAOS2和人微血管内皮细胞HMEC-1中VWF表达模式的差异;(4)利用佛波醇 12-十四酸酯 13-乙酸酯(Phorbol-12-Myristate-13-Acetate,PMA)刺激SAOS2得到VWF高表达的SAOS2细胞;运用免疫荧光实验、流式细胞术(Flow Cytometry,FCM)以及多聚体电泳技术检测PMA处理前后的SAOS2细胞中VWF表达量的差异;(5)在静态和剪切流动条件下分别进行血小板黏附试验以测定VWF高表达的SAOS2细胞与血小板之间黏附情况的变化,使用SZ123、SZ2以及AVW3三种VWF-GPIbα通路阻断抗体来研究该通路在SAOS2细胞与血小板黏附过程中发挥的作用;(6)应用Cell Counting Kit-8(CCK8)实验检测与不同浓度的洗涤血小板共培养后VWF高表达的SAOS2细胞增殖情况的变化;(7)以人胚胎肾细胞HEK293作为阴性对照,利用Transwell迁移和侵袭实验探究VWF高表达的SAOS2细胞与血小板黏附后迁移和侵袭能力的变化;使用以上三种VWF-GPIbα通路阻断抗体来研究该通路在减少血小板的黏附后对SAOS2细胞迁移和侵袭能力的影响;(8)利用ELISA试剂盒检测VWF高表达的SAOS2细胞与血小板共培养后的上清液中血小板衍生生长因子-BB(Platelet derived growth factor-BB,PDGF-BB)和转化生长因子-β1(Transforming growth factor-β1,TGF-β1)的含量,使用以上三种VWF-GPIbα通路阻断抗体来研究该通路被抑制后对上清液中PDGF-BB和TGF-β1含量的影响;(9)应用SPSS 19.0和GraphPad Prism 5.0软件对上述指标进行分析统计,计量资料采用均数±标准差(x±s)表示,以P<0.05为差异有统计学意义。结果:(1)应用ELISA法对66例骨肉瘤患者和60例CTL的血浆VWF抗原水平的检测发现:原位骨肉瘤组、骨肉瘤转移组及CTL组血浆中VWF的含量差异无统计学意义(P>0.05);(2)运用HE和IHC染色对12例骨肉瘤患者的病理组织标本进行检测,结果显示原位骨肉瘤细胞、侵袭性骨肉瘤细胞以及肺转移骨肉瘤细胞内均存在VWF的表达;且2例侵袭性骨肉瘤标本和3例肺转移骨肉瘤标本中骨肉瘤细胞的VWF表达水平显著高于7例原位骨肉瘤;(3)将SAOS2、阴性对照HEK293和人骨肉瘤细胞系MG63的细胞裂解液与阳性对照HMEC-1的细胞裂解液和血小板裂解液进行Western blot检测,结果显示SAOS2、HMEC-1和血小板裂解液中表达一定量的VWF蛋白,而在HEK293和MG63细胞中未检测到VWF蛋白的表达;用异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)标记的兔抗人 VWF IgG 多克隆抗体(FITC conjugated rabbit-anti-human VWF IgG,FITC-RAHVWF IgG)进行免疫荧光检测,结果显示SAOS2细胞的胞质中存在一定量的VWF颗粒小体;VWF多聚体电泳分析显示,SAOS2细胞中的VWF主要以中分子量聚合物的形式存在,而内皮细胞中的VWF则以各种分子量聚合物的形式存在;(4)PMA刺激后的SAOS2细胞中VWF的免疫荧光强度显著高于未刺激的正常SAOS2细胞,且VWF表达水平的增高体现在整个细胞水平;FCM的检测结果也表明PMA刺激后的SAOS2细胞胞膜上VWF的表达水平显著高于未处理的细胞;VWF多聚体电泳检测也得到了相同的结果;(5)静态条件下血小板黏附实验表明VWF高表达的SAOS2细胞对血小板的黏附能力(17.96±0.59%)显著高于未处理的细胞(6.00±0.26%),P<0.001;且VWF-GPIbα通路阻断抗体SZ123,SZ2和AVW3分别加入到实验体系后,AVW3(6.51±0.35%)(P<0.001)和S22(5.50±0.24%)(P<0.001)可以分别减少血小板与SAOS2细胞之间的黏附;而加入SZ123(17.20±0.6%)的实验结果差异不具有统计学意义(P>0.05);诱导剪切流动条件15分钟后,血小板黏附实验表明VWF高表达的SAOS2细胞对血小板的黏附能力(14.96±0.68%)显著高于未处理的细胞(4.97±0.36%),P<0.01。而 AVW3(2.52±0.35%)(P<0.01)、SZ2(1.75±0.19%)(P<0.001)以及S2123(2.11±0.20%)(P<0.001)可以分别减少血小板与SAOS2细胞之间的黏附;(6)应用CCK8实验检测与不同浓度的洗涤血小板共培养后VWF高表达的SAOS2细胞增殖情况的结果显示,至36小时时各组细胞增殖情况的差异达到最大;其中,5×105个血小板组(1.62±0.25)的OD值显著高于5×104个血小板组(1.45±0.29),P<0.05,且5×104个血小板组(1.45±0.29)的OD值显著高于5×103个血小板组(1.31±0.35),P<0.05,而 5×103个血小板组(1.31±0.21)和无血小板组(1.28±0.23)的OD值差异不具有统计学意义(P>0.05);(7)运用Transwell细胞迁移和侵袭实验,探究与血小板共培养后VWF高表达的SAOS2细胞的迁移和侵袭能力;结果显示,血小板共培养组的迁移细胞数目(52.3±6.99)和侵袭细胞数目(32.2±2.55)显著高于仅有细胞组(22.4±3.53、8.1±1.58),P<0.005,而在血小板共培养的实验体系中加入SZ2和AVW3后,迁移的细胞数目(14.4±1.72、14.0±1.81)和侵袭的细胞数目(10.4±1.71、9.1±1.58)较血小板共培养组均显著减少,P<0.001,加入SZ123的实验组迁移的细胞数目(48.6±6.62)和侵袭的细胞数目(30.4±2.04)与血小板共培养组的差异无统计学意义,P>0.05;而阴性对照HEK293细胞的各实验组发生迁移和侵袭的细胞数目差异均无统计学意义,P>0.05;(8)利用ELISA试剂盒检测VWF高表达的SAOS2细胞与血小板共培养后的上清液中PDGF-BB和TGF-β1的水平;结果显示,血小板共培养组的PDGF-BB和TGF-β1水平显著高于仅有血小板组;而在血小板共培养的实验体系中加入0.5ug/mL、1ug/mL和2ug/mL的SZ2和AVW3后,PDGF-BB和TGF-β1的水平较血小板共培养组显著减少,且随着抗体浓度的增加而减少的越明显;加入SZ123的实验组与血小板共培养组PDGF-BB和TGF-β1的水平差异无统计学意义。结论:(1)骨肉瘤的转移与内皮细胞和巨核细胞内合成并释放至血浆中的VWF无关,而与骨肉瘤细胞来源的VWF相关;(2)人骨肉瘤细胞系SAOS2的胞质内遍布以中分子量聚合物形式存在的VWF颗粒小体,这种SAOS2细胞内表达的VWF在合成、储存、分布、结构和功能上不同于内皮细胞中的VWF;(3)通过一定量PMA的刺激成功获得了细胞质和胞膜上高表达VWF的骨肉瘤SAOS2细胞,且这种高表达VWF的细胞可通过胶原-VWF-GPIbα轴与血小板结合形成聚集体,从而激活血小板本身分泌并释放PDGF和TGF-β等生长因子,进一步促进了骨肉瘤细胞的迁移和侵袭;(4)骨肉瘤细胞表达的VWF在骨肉瘤的发生发展中起着重要的作用;这一发现为研制新型抗骨肉瘤转移的治疗药物提供了理论依据,并进一步丰富和完善了骨肉瘤转移的发生机制,具有重要的临床价值。